基于纳米粒子的概念验证生物传感器：利用计算机模拟和体外实验方法检测多种基因型的非洲猪瘟病毒

《ACS Omega》：Proof-of-Concept Nanoparticle-Based Biosensor for Detecting the African Swine Fever Virus Across Multiple Genotypes Using In Silico and In Vitro Approaches

非洲猪瘟病毒（ASFV）的快速检测对防控至关重要。本研究设计了一种基于金纳米颗粒（GNP）的生物传感器，通过计算序列比对（Clustal Omega）和实验分析（光谱吸收）筛选出探针2和5，其检测限低至550拷贝，且特异性高，无交叉反应。统计分析表明，GC含量与灵敏度显著负相关。该传感器为ASFV的现场监测提供了快速、便携的解决方案。

　　非洲猪瘟病毒（African Swine Fever Virus, ASFV）是一种对家猪和野猪具有高度致死性的病毒性出血性疾病，严重威胁全球粮食安全和畜牧业经济。快速而准确地检测 ASFV 是控制疫情爆发的关键。本研究评估了一种基于金纳米颗粒（Gold Nanoparticle, GNP）的生物传感器，该传感器通过针对 ASFV 的 p72 基因设计了八种寡核苷酸探针，旨在识别具有高灵敏度、高特异性以及广泛基因型覆盖能力的最优探针。

为了实现这一目标，研究团队首先使用 Clustal Omega 进行了多个序列比对，以评估探针与不同 ASFV 基因组之间的杂交效率。通过生成百分比同源性矩阵并利用热图进行可视化，研究者能够评估探针在不同基因型中的杂交强度。随后，该生物传感器在合成 ASFV DNA 上进行了测试，反应时间设定为 5 分钟，并采用分光光度法来评估检测效果。灵敏度通过目标 DNA 的连续稀释进行测量，而特异性则通过非目标细菌 DNA 进行验证。

研究结果显示，探针 2（40 个碱基对，GC 含量为 50.0%）和探针 5（60 个碱基对，GC 含量为 54.2%）在整体性能上表现最佳，能够检测到 550 个拷贝的 ASFV DNA，且无交叉反应，同时在多种 ASFV 基因型中表现出强结合能力。使用 Spearman 秩相关分析发现，GC 含量与灵敏度之间存在显著相关性（ρ = ?0.80，p = 0.016），而探针长度、二级结构稳定性以及结合优势等参数则未显示出显著关联。本研究强调了将基因组比对工具与实验生物传感器验证相结合的重要性，以提升探针设计的科学性和实用性。

### ASFV 的生物学特性与影响

ASFV 是一种大型的 170–194 千碱基对（kbp）线性双链 DNA 病毒，属于 Asfarviridae 家族。该病毒的高传染性和致死性使其成为全球畜牧业面临的重要威胁。自 1921 年在肯尼亚首次被记录以来，ASFV 已从非洲的疫区传播至欧洲、亚洲和美洲，造成猪群中接近 100% 的死亡率。随着 ASFV 的持续扩散，开发有效的诊断工具以实现早期检测和控制变得尤为紧迫。

ASFV 的一个重要特征是其能够在环境中长期存活，这使得一旦该病毒进入一个地区，就极难彻底清除。临床表现方面，感染 ASFV 的猪通常会出现高热、食欲减退、皮肤和内脏出血，最终导致死亡。由于 ASFV 的高致病性，其对畜牧业和食品安全构成了重大挑战。特别是在美国，拥有全球最大的猪肉产业之一，一旦 ASFV 引入，预计将造成超过 500 亿美元的经济损失，影响约 14 万个工作岗位，并对农业部门造成长期影响。

尽管采取了严格的生物安全措施， ASFV 仍然难以控制，主要因其在环境中的持久性、通过受污染饲料和媒介物传播的能力，以及缺乏广泛使用的疫苗。虽然越南最近批准了一种减毒活疫苗，但其在全球范围内的适用性仍不确定，因此需要其他策略来实现 ASFV 的检测和控制。快速、可靠、便于携带的诊断方法对于控制 ASFV 疫情至关重要。

### 生物传感器技术的优势

目前，PCR 和 ELISA 是 ASFV 检测的黄金标准，虽然具有高灵敏度和特异性，但需要实验室基础设施、专业人员和较长的处理时间，这限制了其在资源有限地区或现场监测中的可行性。生物传感器则提供了一种有前景的替代方案，能够实现快速、便携和低成本的 ASFV 检测。基于金纳米颗粒的生物传感器利用金纳米颗粒独特的光学特性，能够实现目标 DNA 序列的高灵敏度检测。通过将寡核苷酸探针偶联到金纳米颗粒表面，这些传感器提供了一种颜色读数平台，具有简单、坚固和潜在的现场应用能力。

金纳米颗粒因其独特的光学行为——局域表面等离子共振（Localized Surface Plasmon Resonance, LSPR）——在生物传感领域得到了广泛关注。LSPR 是当光与金纳米颗粒表面相互作用时，激发表面电磁波，从而增强特定波长的光吸收，使金纳米颗粒呈现出独特的光学特性。纳米颗粒的大小在这一过程中起着关键作用，影响吸收带的强度和频率，从而决定其 LSPR 行为。较大的颗粒能够吸收和散射更多光子，改变纳米颗粒的颜色和光学响应。

金纳米颗粒的 LSPR 基础上实现了光吸收和散射。通过在纳米颗粒表面偶联特定的生物分子，这些纳米颗粒可以被设计成检测目标分子的高灵敏度和高特异性工具。这一特性使金纳米颗粒在 ASFV 检测中具有显著优势。然而，开发针对 ASFV 的分子诊断工具面临的一个关键挑战是病毒的基因型多样性。历史上， ASFV 被分为 24 种基因型，基于 p72 基因编码的主衣壳蛋白，该基因是 ASFV 基因组中最为保守的区域之一。这种基因型的多样性引发了对现有分子检测方法是否能可靠检测所有毒株的担忧。因此，探针设计必须经过评估，以确保其在这些不同基因型之间的杂交能力，从而实现广泛的应用和高诊断覆盖率。

### 探针设计与筛选过程

本研究的目标是设计一种基于金纳米颗粒的生物传感器，通过评估针对 p72 基因的八种寡核苷酸探针，以优化其灵敏度、特异性和基因型覆盖能力。首先，通过 Clustal Omega 进行了多个序列比对，以评估探针与不同 ASFV 基因组之间的杂交效率。通过生成百分比同源性矩阵并使用热图进行可视化，研究者能够评估探针在不同基因型之间的杂交强度。这一步骤为后续的实验分析奠定了基础，使研究者能够快速预测探针与目标之间的相互作用。

在实验设计中，为了评估探针的性能，研究者采用了合成 ASFV DNA 进行测试，浓度范围从 4400 拷贝到最低检测限。特异性则通过非目标细菌 DNA 进行验证，包括大肠杆菌 O157、沙门氏菌 Enteritidis 和金黄色葡萄球菌。这些细菌在猪场环境中普遍存在，包括口液、粪便、栏位灰尘和饲料灰尘。空气和表面调查反复报告金黄色葡萄球菌是主要或临床相关的空气传播细菌和饲料污染菌，表明猪场中存在频繁的口腔和环境接触。因此，这些细菌代表了在实际应用中可能干扰生物传感器的高负担的非目标微生物。

### 生物传感器的实验与性能分析

为了进一步验证探针的性能，研究者设计了实验以评估生物传感器的灵敏度和特异性。实验中使用了分光光度法，通过 NanoDrop One-C 仪器记录吸收光谱，以评估生物传感器的检测效果。灵敏度的评估基于目标 DNA 的连续稀释，而特异性则通过比较目标 DNA 与非目标细菌 DNA 的吸收光谱进行分析。结果显示，探针 2 和探针 5 在所有非目标细菌中表现出完全的特异性，并且在多种 ASFV 基因型中表现出强结合能力。

统计分析表明，GC 含量与灵敏度之间存在显著相关性，而探针长度、二级结构稳定性以及结合优势等参数则未显示出显著关联。这一发现表明，GC 含量是探针性能的更强决定因素。在实际应用中，GC 含量的平衡有助于探针与目标 DNA 的稳定双链形成，而不会引入过多的二级结构。因此，GC 含量在生物传感器设计中具有重要地位。同时，探针的结合优势并未与灵敏度结果形成一致，例如，探针 1 虽然表现出最高的结合优势，但需要 2200 拷贝才能被检测到，而探针 2 和探针 5 在 550 拷贝的浓度下即可被检测到。这表明结合优势虽然在理论上具有参考价值，但在实际数据中并未可靠地预测灵敏度。

### 探针的性能与优化

通过 Clustal Omega 的初步分析，所有八种探针都显示出至少部分互补性，支持其在后续实验中的使用。热图和条形图分析显示，探针 2、5 和 6 表现出较高的平均同源性值，特别是对基因型 II、IX 和 XV。相比之下，探针 4、7 和 8 在所有基因型中表现出较弱的结合能力，表明其杂交潜力有限。这些结果表明，探针 2、5 和 6 在 ASFV 检测中具有更好的性能。

进一步的实验分析表明，探针 2 和 5 在所有非目标细菌中表现出完全的特异性，且在多种 ASFV 基因型中均能实现有效的检测。灵敏度测试结果显示，探针 2 和 5 能够检测到 550 拷贝的 ASFV DNA，而探针 1、7 和 8 则需要更高的浓度（1100–2200 拷贝）才能产生可检测信号。这表明探针 2 和 5 在实际应用中具有更高的灵敏度和特异性，使其成为最合适的候选探针。通过延长反应时间至 10 分钟，研究者进一步验证了探针的性能，结果表明探针 2 和 5 在更长的反应时间下仍能保持检测能力，增强了其在实际环境中的适用性。

### 未来展望与改进方向

本研究的发现为未来基于金纳米颗粒的 ASFV 生物传感器设计提供了重要参考。GC 含量被确认为探针性能的关键决定因素，这一特性在探针设计中具有指导意义。为了进一步提升生物传感器的实用性，研究者建议将该平台集成到便携式诊断格式中，以便在实际应用中进行现场检测。此外，研究者还建议通过国际合作，在 ASFV 流行地区进行临床样本的验证，以评估其在真实世界中的诊断性能。

未来的工作应集中在验证该生物传感器在临床样本中的表现，以及探索探针对新兴 ASFV 基因型的适应性，以确保持续的诊断可靠性。通过将该生物传感器集成到常规监测计划中，可以实现早期检测，特别是在 ASFV 引入风险较高的地区。通过减少诊断周转时间和增加可及性，该平台有望提高全球 ASFV 生物安全，并促进及时的疫情应对。此外，研究者还建议在实际应用中引入智能手机成像和颜色分析工具，以标准化视觉阈值，减少光照变化的影响，并提供可靠的现场检测结果。