设计并评估一种双重靶向放射性核素疗法，用于治疗NTS1疾病，通过内溶酶体捕获机制提高肿瘤滞留效果

《ACS Omega》：Design and Evaluation of Dual-Targeted Radionuclide Therapeutics for NTS1 with Improved Tumor Retention through Endolysosomal Trapping

靶向神经tensin受体1的放射药物开发及结构活性关系研究。通过引入不可逆半胱氨酸蛋白酶抑制剂（CPTA），构建新型靶向化合物并评估其体内肿瘤滞留效果。研究表明，连接链的化学结构（如正电荷烷基胺链8c）可提高NTS1结合亲和力与细胞摄取效率，同时形成稳定加合物延长肿瘤滞留（17.8%-28%）。然而，CPTA的引入显著增加肾脏摄取（8.6%-21%），需优化设计以平衡靶向效率与肾毒性。

　　这项研究探讨了将不可逆的半胱氨酸蛋白酶抑制剂（CPTA）整合到神经紧张素受体亚型1（NTS1）靶向构建体中的策略，旨在通过形成加合物来增强肿瘤的保留能力。研究中提出了一种新的CPTA-NTS1靶向剂（CPTA-NTS1TA）模型，分析了一系列烷基、烷基胺和醚类连接子对结构-活性关系的影响。这些CPTA-NTS1TA构建体（如[1??Lu]Lu-8a-e）在NTS1上的结合亲和力达到纳摩尔级别（9-38 nM），并且能够迅速且不可逆地抑制半胱氨酸蛋白酶（如组织蛋白酶B）。实验结果表明，某些连接子的正电荷（如[1??Lu]Lu-8c）或较低的立体位阻（如[1??Lu]Lu-8a）能够提升NTS1靶向能力。尽管这些实验构建体的肿瘤摄取率（4.6 ± 0.7-16.5 ± 1.2%ID/g）通常低于临床试验中的基准对照[1??Lu]Lu-3BP-227（20.8 ± 1.1%ID/g），但所有含有不可逆抑制剂的构建体在肿瘤保留率方面表现更优（17.8 ± 1.5-28 ± 7%），相对于[1??Lu]Lu-3BP-227（13 ± 2%）具有显著提升。研究结论指出，这些双靶向构建体的结构-活性关系提供了有价值的见解，为未来改进肿瘤摄取率和减少NTS1靶向放射性药物的肾保留率提供了理论依据。

### 研究背景与意义

结直肠癌（CRC）是全球最常见的癌症之一。局部CRC的五年生存率超过90%，但转移性CRC的临床生存率则显著下降，约为16%。CRC的高致死性主要源于其高复发率、晚期诊断的普遍性以及缺乏有效的系统性治疗手段。因此，开发更具针对性和有效性的治疗策略对于改善CRC患者的预后至关重要，特别是对于那些患有转移性疾病的患者。NTS1作为一类G蛋白偶联受体（GPCR）的成员，其在胃肠道和神经系统中广泛表达，但在CRC及其他多种恶性肿瘤中也表现出较高的表达水平。因此，NTS1被视为系统性癌症治疗的有前景的靶点。在放射性药物开发方面，早期研究主要集中在神经紧张素的合成肽衍生物上。近年来，研究者开始探索使用小分子药效团，如SR142948A，这是一种在21世纪初开发的拮抗剂。这一方法促成了新型的NTS1靶向药物（[1??Lu]Lu-3BP-227）的开发，该药物在临床前和临床试验（NCT03525392）中表现出良好的体内靶向性。然而，尽管[1??Lu]Lu-3BP-227表现出显著的NTS1介导的肿瘤摄取，其快速洗脱特性导致可交付的放射剂量不足，限制了其临床潜力。

为了克服这一问题，本研究实验室开始探索将不可逆的半胱氨酸蛋白酶抑制剂整合到低分子量的NTS1靶向药物中，以延长其在肿瘤中的停留时间。这一方法被称为溶酶体捕获，其目的是通过在溶酶体中形成不可逆的加合物来提高药物的靶向性。本研究进一步探讨了不同的连接子结构如何影响这些双靶向药物的生物性能。实验表明，连接子的结构和性质对NTS1的结合亲和力和抑制动力学具有一定的影响。此外，实验构建体的体内分布和肿瘤保留能力也得到了评估。

### 实验方法与结果

#### 合成过程

CPTA-NTS1TA构建体的合成涉及一系列多步骤的化学反应，使用标准的酰胺偶联剂（如方案1所示）。虽然使用EDCI-NHS可以成功合成1a-e，但在连接子c的反应中，观察到两个主要的副产物（m/z 580），这影响了产物的产率和纯化过程。这些副产物可能与在偶联过程中形成的O-酰基尿素中间体的稳定有关。与其他连接子不同，连接子c含有多个N-甲基化基团和一个灵活的丙基链，这可能临时稳定O-酰基尿素中间体，导致其向NHS活化酯的转化被延迟。因此，通过改变连接子的结构，可以优化合成过程并减少副产物的形成。为了提高产率和纯度，1c被成功偶联使用HBTU/HOBt，从而改善了产物的产率和纯度。

#### 放射标记

CPTA-NTS1TA构建体的放射标记产率在60-80%之间。非放射性及放射性Lu标记的CPTA-NTS1TA构建体（Lu-8a-e）分别通过与LuCl?和1??LuCl?反应合成，反应在0.1 M醋酸钠缓冲液（pH = 5.5）中进行，温度为85°C（方案2）。为了提高色谱分辨率和便于纯化，反应后加入CuSO?以螯合任何未反应的前体。这一策略改善了非放射性与放射性Lu标记物种在HPLC纯化过程中的分离，减少了峰重叠并提高了化合物的纯度。所有未标记和Lu标记的CPTA-NTS1TA构建体均通过高分辨率质谱（HRMS）进行无歧义的鉴定和表征。

#### 体外NTS1受体竞争性细胞结合研究

为了评估CPTA-NTS1TA构建体与NTS1的结合亲和力，使用了NTS1阳性的HT-29结肠癌细胞系。所有构建体均表现出较低的纳摩尔结合亲和力（9-37 nM），其中8e的结合亲和力显著高于其他构建体（p < 0.001）。未标记和放射性Lu标记的构建体之间没有显著的结合亲和力差异（p > 0.99），这表明金属化并未显著影响NTS1的亲和力。连接子为烷基和烷基胺的构建体（8a-c）表现出比醚类连接子（8d-e）更高的结合亲和力。尽管8a的结合亲和力最高，但其在细胞内的摄取率却是所有构建体中最低的。这一现象表明，NTS1结合亲和力并不总是预测受体介导的内吞作用，还有其他因素影响内吞过程。

#### 体外加合物形成研究

通过SDS-PAGE自显影研究评估了CPTA-NTS1TA构建体与人类组织蛋白酶B（CatB）的加合物形成能力。所有研究中，加载样品均被归一化为放射性含量。[1??Lu]Lu-8a-e在CatB（人类肝脏）中孵育1小时后进行分析，观察到两个带，一个对应于CatB加合物（约32 kDa），另一个带（<10 kDa）对应于未加合的[1??Lu]Lu-CPTA-NTS1TA构建体。CatB加合物带占总信号的25.8-27.4%。对于HT-29细胞裂解物，同样观察到多个带，分子量约为25-35 kDa，这与CatB加合物的分子量范围一致。这表明，连接子的修饰并未影响构建体对CatB的特异性。通过体外加合物形成研究，发现[1??Lu]Lu-8a-e的加合物形成效率并未受到结构变化的显著影响。

#### 体内分布研究

所有放射性构建体在HT-29肿瘤异种移植小鼠模型中进行了体内分布研究，时间点为4、24、72和168小时。[1??Lu]Lu-8a-e在4小时内的血液清除率（1.04 ± 0.14-3.3 ± 0.6%ID/g）优于临床对照[1??Lu]Lu-3BP-227（14 ± 4%ID/g）。尽管[1??Lu]Lu-8a-e的肿瘤摄取率低于[1??Lu]Lu-3BP-227，但它们在后续时间点表现出更好的肿瘤保留率。例如，在168小时后，[1??Lu]Lu-8c和[1??Lu]Lu-8d的肿瘤保留率显著高于[1??Lu]Lu-3BP-227（p ≤ 0.0199）。此外，研究还发现，放射性构建体的肾摄取率显著高于[1??Lu]Lu-3BP-227，这可能与加合物形成有关。虽然[1??Lu]Lu-8d的初始肾摄取率显著高于其他构建体，但在4-24小时内迅速清除，导致所有实验构建体的肾保留率在24小时后相似。在168小时后，[1??Lu]Lu-8a-e的肾保留率显著高于[1??Lu]Lu-3BP-227，这可能表明加合物在肾组织中的形成更为有效。然而，所有构建体的肿瘤摄取率低于[1??Lu]Lu-3BP-227，导致其绝对肿瘤保留率较低。

#### 体内肿瘤摄取与保留

在体内研究中，[1??Lu]Lu-8c表现出最高的肿瘤摄取率（16.5 ± 1.2%ID/g），其次是[1??Lu]Lu-8a（11.6 ± 1.1%ID/g）。这些构建体的肿瘤摄取率与体外竞争结合实验结果一致，表明连接子的结构对结合亲和力和内吞效率有一定影响。尽管[1??Lu]Lu-8a-e的肿瘤摄取率低于[1??Lu]Lu-3BP-227，但它们在后续时间点表现出更好的肿瘤保留率。例如，在168小时后，[1??Lu]Lu-8c和[1??Lu]Lu-8d的肿瘤保留率显著高于[1??Lu]Lu-3BP-227，这表明加合物的形成在体内起到了重要作用。然而，由于肿瘤摄取率较低，这些构建体的绝对肿瘤保留率也相对较低。

#### 肾脏保留与肿瘤-肾脏比值

所有构建体在体内分布研究中表现出显著的肾保留率，远高于[1??Lu]Lu-3BP-227。这可能与构建体中不可逆抑制剂的加入有关，导致加合物的形成。其中，[1??Lu]Lu-8d的初始肾摄取率显著高于其他构建体，但在4-24小时内迅速清除，导致所有实验构建体在24小时后的肾保留率相似。在168小时后，[1??Lu]Lu-8c的肾保留率显著高于其他构建体，这可能表明其在肾组织中的加合物形成更为有效。然而，[1??Lu]Lu-8a的肾清除率较快，导致其在168小时后的肿瘤-肾脏比值优于[1??Lu]Lu-8c，但仍低于[1??Lu]Lu-3BP-227。因此，未来研究的重点将是优化构建体的结构，探索肾保留剂，以减少肾脏摄取。

#### 体外加合物形成与内吞作用

体外SDS-PAGE自显影研究显示，[1??Lu]Lu-8a-e能够高效地与细胞内的蛋白质形成加合物，这可能表明它们与细胞内的半胱氨酸蛋白酶（如CatB）结合。研究发现，内吞作用是加合物形成的前提条件。通过SDS-PAGE图像分析，发现每种细胞裂解物中约有一半的放射性与加合物相关，表明在内吞后加合物形成较为高效。然而，尽管这些构建体的加合物形成效率较高，但其对不同组织的摄取和保留能力仍需进一步优化。

#### 体内分布与靶向效率

体内分布研究显示，[1??Lu]Lu-8a-e在4小时内的血液清除率优于临床对照[1??Lu]Lu-3BP-227。尽管这些构建体的肿瘤摄取率较低，但它们在后续时间点表现出更好的肿瘤保留率。这表明，加合物的形成在体内起到了重要作用。然而，由于肿瘤摄取率较低，这些构建体的绝对肿瘤保留率也相对较低。此外，所有构建体在体内表现出显著的肾保留率，这可能影响其临床应用。

#### 统计分析

所有统计分析使用GraphPad Prism（版本10.4.2，GraphPad Software，美国加利福尼亚州圣地亚哥市）。数据通过双因素方差分析（two-way ANOVA）评估不同放射性CPTA-NTS1TA构建体与时间点之间的差异，随后使用Tukey的多重比较测试（Tukey’s multiple comparisons test）确定统计显著性。在必要时，数据进行了对数转换或基线校正，以确保正态性和方差齐性。p值≤0.05被认为是统计显著的，但在某些情况下，更严格的阈值（如p ≤ 0.01、p ≤ 0.001、p ≤ 0.0001）也被采用，以突出重要的研究发现。

### 研究结论

这项研究探讨了多种新的NTS1靶向放射性药物，通过整合不可逆的半胱氨酸蛋白酶抑制剂（CPTA）来提高肿瘤保留率。具体而言，研究分析了不同连接子（烷基、烷基胺和醚类）对构建体生物性能的影响。所有CPTA-NTS1TA构建体（如[1??Lu]Lu-8a-e）均表现出良好的NTS1结合亲和力和抑制动力学。连接子的修饰对抑制动力学和细胞内吞作用有一定影响。体内分布研究显示，[1??Lu]Lu-8a-e的血液清除率优于临床对照[1??Lu]Lu-3BP-227。尽管这些构建体的肿瘤摄取率低于[1??Lu]Lu-3BP-227，但它们在后续时间点表现出更好的肿瘤保留率。[1??Lu]Lu-8c和[1??Lu]Lu-8d的肿瘤保留率显著高于[1??Lu]Lu-3BP-227，表明加合物的形成对肿瘤保留率有显著贡献。然而，整合CPTA导致[1??Lu]Lu-8a-e的肾保留率显著高于[1??Lu]Lu-3BP-227。这些结果为CPTA-NTS1靶向构建体的结构-活性关系提供了有价值的见解，表明整合不可逆的半胱氨酸蛋白酶抑制剂可能是一种提高NTS1靶向放射性药物疗效的有前景策略。未来研究将集中在优化这些新构建体，以减少肾保留率，同时提高肿瘤摄取和保留特性。