一种乳铁蛋白B/布弗林嵌合肽能够快速、选择性地对HPV18阳性的宫颈癌细胞产生长期的细胞毒性作用，并诱导其发生凋亡

《ACS Omega》：A Lactoferricin B/Buforin Chimeric Peptide Causes a Rapid, Selective, Prolonged Cytotoxic Effect and Induces Apoptosis in HPV18-Positive Cervical Cancer Cells

宫颈癌治疗 chimeric peptide KKWQWK-Ahx-RLLRRLLR 诱导凋亡的机制研究 细胞毒性测试发现该肽在HeLa和Ca Ski细胞中快速高效诱导凋亡，通过非内吞途径进入细胞，并激活caspase 3/7。动物模型显示低毒性，适合临床前研究。

　　这项研究聚焦于一种名为CH-1的嵌合肽（KKWQWK-Ahx-RLLRRLLR）及其与HPV18阳性宫颈癌细胞（如HeLa和Ca Ski细胞）的相互作用。研究的主要目标是揭示该嵌合肽在细胞毒性作用中的机制，包括其细胞内化过程和引发的细胞死亡类型。通过一系列体外和体内实验，研究发现CH-1的细胞内化过程并非依赖于能量，可能涉及被动运输机制。同时，研究确定了该嵌合肽主要通过诱导早期和晚期凋亡，而不是坏死，来发挥其细胞毒性作用，并激活了caspase 3和7。此外，该嵌合肽在癌细胞的细胞质和细胞核中均有分布，表明其可能与细胞内的靶点发生相互作用。综上所述，这项研究为理解CH-1对癌细胞的作用机制提供了更全面的视角，突出了其在宫颈癌治疗中的潜力，即通过凋亡途径快速、特异性地发挥显著的细胞毒性作用。

### 研究背景

宫颈癌是全球女性健康的主要威胁之一，尤其在发展中国家，其高死亡率主要归因于早期检测手段的不足、疫苗接种率低以及治疗方案的局限性。尽管在预防和治疗方面取得了一定进展，如人乳头瘤病毒（HPV）疫苗和巴氏涂片检测技术，以及手术、放疗和化疗等治疗手段，但宫颈癌仍是一个挑战，因为它对传统疗法表现出抗性。因此，探索新的治疗策略对于提高临床疗效和改善患者生活质量至关重要。

肽嵌合体作为新型治疗药物，近年来在抗癌研究中展现出巨大潜力。这些分子通过结合不同肽序列，可以特异性地靶向癌细胞并触发细胞死亡机制。一些含有乳铁素B（LfcinB）衍生序列的嵌合肽，如RWQWRWQWR和RLLRRLLR，已经显示出对宫颈癌细胞（如HeLa和Ca Ski细胞）的显著细胞毒性。此外，CH-1在抗菌和抗真菌方面也表现出活性，对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和粪肠球菌等微生物有抑制作用。同时，它对乳腺癌细胞MCF-7和宫颈癌细胞HeLa也表现出显著的细胞毒性。这些发现表明，CH-1具有广泛的生物活性，可能在癌症治疗中具有重要应用价值。

### 实验方法

研究采用多种技术手段对CH-1进行分析和评估。首先，通过固相肽合成（SPPS）Fmoc/tBu方法合成CH-1，该方法利用200毫克或700毫克的Rink酰胺树脂作为固相载体。合成过程中，使用了Fmoc保护基团去除、氨基酸偶联以及最终的切割和脱保护步骤。为了验证合成的纯度和分子量，采用了反相高效液相色谱（RP-HPLC）和液相色谱-质谱（LC–MS）分析。此外，通过傅里叶变换红外光谱（FT-IR）和核磁共振（NMR）进一步研究了CH-1的分子结构。

为了评估CH-1对宫颈癌细胞的细胞毒性，研究采用了MTT细胞活力检测法。通过将细胞与不同浓度的CH-1孵育不同时间，观察细胞存活率的变化。同时，为了探讨CH-1的细胞内化机制，进行了温度、ATP耗竭和内化抑制剂处理的实验。结果显示，即使在低温下，CH-1的细胞毒性仍然存在，表明其内化过程可能不依赖于能量。此外，使用内化抑制剂（如尼斯塔丁和氯丙嗪）处理细胞后，CH-1的细胞毒性并未受到影响，进一步支持其内化机制与内吞作用无关。

为了进一步确认细胞死亡类型，研究采用流式细胞术结合Annexin V和7-AAD荧光标记进行检测。结果显示，CH-1主要诱导早期和晚期凋亡，而坏死事件的比例极低，表明其作用机制以凋亡为主。同时，通过检测caspase 3和7的活性，研究发现CH-1能够激活这些凋亡执行酶，进一步支持其通过凋亡途径引发细胞死亡的结论。

此外，研究还使用了荧光显微镜和对比显微镜观察CH-1对细胞形态的影响。结果表明，CH-1处理后，细胞出现显著的形态变化，如细胞体积缩小、细胞质密度增加、细胞变圆和空泡形成。这些变化在5分钟内即可见到，表明其作用非常迅速。通过将CH-1标记为Rhodamine B（RhB-CH-1），研究进一步确认了其在细胞质和细胞核中的分布情况，表明其能够进入细胞并作用于细胞内的多个靶点。

为了评估CH-1的体内安全性，研究使用了果蝇（Galleria mellonella）和斑马鱼（Danio rerio）作为模型生物。果蝇实验显示，CH-1在400 μg/mL（20 mg/kg）时存活率为80%，而在600 μg/mL（30 mg/kg）时存活率为75%。而在50 μg/mL时，CH-1在斑马鱼胚胎中表现出一定的毒性，但并未导致严重的形态异常，说明其在体内具有一定的安全性和可接受的毒性水平。

### 实验结果

通过一系列实验，研究发现CH-1对HPV18阳性宫颈癌细胞具有显著的细胞毒性作用。其细胞毒性具有快速、浓度依赖性和选择性，且在细胞内化过程中不依赖于能量。这意味着CH-1的细胞内化可能通过某种特定的细胞膜相互作用机制实现，而非通过传统的内吞作用。进一步的分析表明，CH-1的细胞毒性作用主要通过诱导凋亡，而不是坏死，这与caspase 3和7的激活有关。

在细胞形态学分析中，CH-1处理后的细胞表现出明显的形态变化，如细胞体积缩小、细胞质密度增加、细胞变圆和空泡形成。这些变化在5分钟内即可见到，表明其作用迅速。同时，使用RhB标记的CH-1（RhB-CH-1）进一步证实了其在细胞内的分布，不仅在细胞质中，还在细胞核中，这可能与其能够与细胞内多种靶点相互作用有关。

研究还通过竞争实验评估了CH-1的前体肽是否会影响其细胞毒性。结果显示，前体肽（如RLLRRLLR和KKWQWK）本身对HeLa细胞没有显著的细胞毒性作用，说明CH-1的细胞毒性作用依赖于两个序列的结合。此外，当细胞在不同时间点接受CH-1处理时，细胞活力随时间呈下降趋势，表明其作用具有持续性。

在体内实验中，CH-1在果蝇和斑马鱼中表现出一定的毒性，但其毒性水平在果蝇中较高，在斑马鱼中则相对较低。这表明CH-1在不同生物模型中的安全性可能存在差异，需要进一步研究以确定其在人体中的应用潜力。同时，研究还发现，CH-1在不同浓度下的细胞毒性作用具有可预测性，这为其后续的临床前研究提供了依据。

### 讨论与结论

研究发现，CH-1的合成和纯化过程是可行的，且在不同批次中表现出一致的结构和活性。通过FT-IR和NMR分析，CH-1和RhB-CH-1均表现出α-螺旋结构，这可能与其细胞毒性作用有关。此外，研究还发现，CH-1的细胞毒性作用主要依赖于其序列中特定的结合位点，如（RLLR）2基序，这可能与其能够穿透细胞膜并进入细胞内部有关。

CH-1的细胞毒性作用主要通过诱导凋亡实现，而非坏死。这一结论得到了多种实验的支持，包括流式细胞术检测细胞死亡类型、caspase 3和7活性检测以及细胞形态学分析。同时，研究还发现，CH-1的细胞毒性作用具有持续性，即使在处理后24小时或48小时，其作用依然存在，这表明其可能在治疗中具有长期效果。

在体内实验中，CH-1在果蝇中表现出较高的毒性，但在斑马鱼中则相对较低，这可能与其在不同生物体内的代谢和分布有关。尽管其在果蝇中表现出一定毒性，但在斑马鱼中则相对安全，这为其在临床前研究中的应用提供了可能性。

综上所述，CH-1作为一种由两个低活性序列结合而成的嵌合肽，表现出显著的细胞毒性作用，能够快速、特异性地诱导宫颈癌细胞凋亡，同时在体内模型中表现出一定的安全性。这些发现为CH-1在宫颈癌治疗中的应用提供了理论依据和实验支持，表明其可能成为一种有效的新型抗癌药物。然而，进一步的研究需要探讨其在不同类型的宫颈癌细胞中的作用机制，以及其在人体中的安全性和有效性。