综述：用于优化mRNA疫苗的工程交付技术

《ACS Nano Medicine》：Engineering Delivery Technologies for Optimizing mRNA Vaccines

mRNA疫苗的递送系统是关键，主要采用脂质纳米颗粒（LNPs）、聚合物纳米颗粒、混合纳米颗粒等载体。LNPs通过优化离子脂质结构、辅助脂质和PEG修饰提升稳定性和靶向性，如 SORT策略和材料库筛选。聚合物纳米颗粒克服了LNPs的肝脏富集问题，通过可降解聚酯和zwitterionic聚合物增强安全性。混合纳米颗粒（如LPPs）结合脂质和聚合物的优势，促进抗原表达和免疫激活。此外，生物衍生载体（如外泌体、病毒样颗粒）和材料（如碳点、磷酸钙）展示了独特优势。研究还探讨了给药途径（肌肉注射、吸入、口服）对递送效果的影响，以及如何通过载体设计减少炎症反应和肝脏积累。未来需结合多学科优化载体性能，平衡免疫激活与安全性。

　　mRNA疫苗代表了一种突破性的疾病预防和治疗手段，例如新冠（COVID-19）疫苗、呼吸道合胞病毒（RSV）疫苗以及一些治疗性癌症疫苗。为了充分发挥其潜力，一种有效的递送系统至关重要，它能够确保抗原编码mRNA的稳定性，促进其进入目标细胞，并推动抗原蛋白的表达。此外，优化疫苗功能对于期望的mRNA疫苗特性也具有重要意义，例如将mRNA定向递送至抗原呈递细胞（APCs）、产生足够的免疫刺激以及安全的药理特性。在这篇综述中，我们探讨了mRNA疫苗递送技术的最新进展，包括脂质纳米颗粒（LNPs）、聚合物纳米颗粒、混合载体以及其他系统。随后，我们将总结用于提升mRNA疫苗性能的具体策略，包括增强免疫刺激、实现mRNA的定向有效递送、选择最佳的给药途径以及提升安全性。我们的目标是为读者提供更深入的理解，关于递送技术在推进mRNA疫苗开发中的关键作用。

在疫苗开发过程中，实现足够的mRNA稳定性、有效的抗原表达、适当的免疫刺激以及安全的药理特性是高度需求的，以满足临床对传染病和癌症治疗的需要。到目前为止，已通过医药化学、材料科学、药剂学和免疫学的交叉研究做出了大量努力以达到这些目标。尽管抗原表达的mRNA分子已被广泛优化以减少免疫原性并提升稳定性和翻译效率，我们在这里聚焦于推动下一代mRNA疫苗的递送技术。这些进展为mRNA载荷、递送载体和免疫系统之间的复杂相互作用提供了宝贵的见解。本文从mRNA疫苗递送系统的概述开始，随后详细讨论了优化这些疫苗的策略，最后提供了对未来mRNA疫苗递送技术存在的挑战的展望，希望能激发热情和灵感，推动mRNA疫苗领域向前发展。

mRNA疫苗的临床转化受到一些固有障碍的阻碍。首先，mRNA分子具有高分子量，高度不稳定，易受血液中广泛分布的RNases影响。因此，需要有效的递送载体来保护mRNA免受降解。其次，装载mRNA的递送系统必须穿过细胞膜和内体屏障，以确保在细胞质中有效表达mRNA。第三，mRNA载体的免疫原性应得到良好调节，而不损害体内耐受性。尽管病毒载体已被用于递送mRNA ex vivo或in vivo，但它们的安全性问题，包括转基因插入和不必要的免疫原性，仍未解决。幸运的是，各种非病毒载体，包括脂质纳米颗粒（LNPs）、聚合物聚体、混合纳米颗粒和生物来源的囊泡，已被广泛开发以应对上述挑战，并用于开发预防性和治疗性mRNA疫苗。

总体而言，在疫苗开发中，实现足够的mRNA稳定性、有效的抗原表达、适当的免疫刺激和安全的药理特性是高度需求的，以满足临床对传染病和癌症治疗的需要。到目前为止，已通过医药化学、材料科学、药剂学和免疫学的交叉研究做出了大量努力以达到这些目标。尽管抗原表达的mRNA分子已被广泛优化以减少免疫原性并提升稳定性和翻译效率，我们在这里聚焦于推动下一代mRNA疫苗的递送技术。这些进展为mRNA载荷、递送载体和免疫系统之间的复杂相互作用提供了宝贵的见解。本文从mRNA疫苗递送系统的概述开始，随后详细讨论了优化这些疫苗的策略，最后提供了对未来mRNA疫苗递送技术存在的挑战的展望，希望能激发热情和灵感，推动mRNA疫苗领域向前发展。

mRNA疫苗的递送系统包括LNPs、聚合物基载体和脂质-聚合物混合纳米颗粒。此外，其他类型的载体，如生物来源的载体和无机纳米颗粒，也被探索。这些不同载体的优势和局限性在表1中列出。表1详细列举了现有非病毒mRNA疫苗递送系统的优缺点。

在mRNA疫苗的递送系统中，LNPs被认为是最先进的递送系统之一，广泛用于Pfizer-BioNTech和Moderna的mRNA疫苗以及商业化的siRNA药物Partisiran。与其它mRNA疫苗载体相比，LNPs提供了独特的优点，如组分多为小分子，化学结构易于控制；LNPs易于规模化生产；LNP组分可生物降解且生物相容性好，其降解产物对人体相对安全；此外，脂质材料结构和配方参数的多样性为优化载体特性提供了巨大的机会，如增强内体逃逸、器官靶向性和免疫原性调节。最近，一些研究挑战了LNPs的四组分配方范式，表明一些简化的LNPs可以表现出增强的靶向性和递送效率。例如，Xu小组设计了具有内源性肝、肺和淋巴结靶向性的生物可降解离子脂质库。在另一个研究中，Mitchell小组设计了一系列含硅氧烷的离子脂质，制备了硅氧烷掺入的LNPs（SiLNPs）。硅氧烷基团可以促进LNPs的细胞摄取并增强内体逃逸。此外，轻微改变硅氧烷含有的脂质oid结构可以控制靶向递送至肝、肺或脾。使用器官特异性SiLNPs，实现了肝和肺的高效基因敲除，而肺靶向的Si5–N14 LNPs可以有效治疗病毒诱导的肺损伤。理性设计是另一种开发离子脂质的便捷方法，通过将具有已知功能的结构整合到脂质中，可以提供独特的优势。例如，维生素C、神经递质和双膦酸盐已被用于设计离子脂质，以促进对巨噬细胞、大脑神经细胞和骨微环境的靶向递送。

除了离子脂质之外，其他组分被称为“辅助脂质”，它们在维持纳米颗粒完整性以及促进mRNA递送中也发挥着重要作用。例如，Patel等人发现，胆固醇环和烷基尾的结构变化会影响粒子组织和形态，从而影响转染效率。将C-24烷基植烷类物质纳入LNPs（eLNPs）可以诱导多面体形状，提高细胞摄取、细胞内扩散性和最终的基因递送效率。PE基的磷脂被证明有助于mRNA递送，磷脂电荷可以调节器官靶向性。在另一项研究中，磷脂化学被显著扩展，制备了多种尾部离子化磷脂（iPhos）库，具有强大的膜破坏能力。优化后的iPhos含有小的两性离子头和三尾结构，有助于内体中的相变和随后的mRNA释放。结构-功能关系研究显示，链的位置和长度可以控制体内mRNA递送效率和器官亲和力。领先的9A1P9基LNPs介导了高效的CRISPR-Cas9基因编辑。

PEG-脂质结构显著控制其解吸动力学，影响LNPs的血清抗性、细胞摄取和转染效率。Gao等人制备了含有不同结构的PEG-脂质LNPs，以研究其对mRNA递送的影响。快速解吸的PEG脂质可能导致肝Kupffer细胞的增强积累，而将终端基团从甲氧基更换为羧基或胺基可以显著增强mRNA在肝中的递送。然而，高表面密度的PEG可能阻碍细胞摄取，这被称为“PEG困境”。此外，一些研究报告称PEG引发的免疫反应，包括抗体介导的加速血清清除（ABC）现象和补体激活相关伪过敏（CARPA）。为了解决这些问题，一些水溶性聚合物已被设计为PEG的替代品，包括聚二甲氨基乙酸、聚乙二醇、聚氧化唑烷和两性离子聚合物。例如，聚乙基乙醇磷酸（PEEP）由于其良好的生物降解性和低免疫原性被合成作为替代的隐身基团。PEEP表现出较低的免疫原性和重复给药后生成的可忽略的抗PEEP抗体、IgM和IgG。此外，PEEP修饰的LNP疫苗在两次接种后诱导了强效T细胞免疫，并与免疫检查点阻断协同作用以消除小鼠中的肿瘤。总体而言，LNPs代表了mRNA递送技术的一个前沿范式，具有可调的函数和在各种治疗应用中的潜在价值。

聚合物基纳米颗粒是另一种具有潜力的mRNA疫苗递送系统。聚合物是具有相对高分子量的分子。虽然聚合物纳米颗粒在mRNA疫苗递送方面不如LNPs那样在临床中建立，但它们提供了独特的优点。值得注意的是，聚合物纳米颗粒可以克服LNPs的肝靶向性，表现出对热处理和冻干的优越稳定性。研究表明，与LNPs相比，聚合物载体在肌肉注射后表现出更持续的mRNA表达和较少的肝积累，这有利于疫苗应用。此外，聚合物的化学结构高度可调，可以通过单体结构、侧链、末端基团、单体比例和分子量的调整来控制聚合物的性质。不仅如此，聚合物纳米颗粒是制备吸入式或口服式mRNA疫苗的有前景的候选者，具有较长的保质期，有助于更广泛的疫苗接种和预防亚优的疫苗积累，以提高疗效和安全性。各种纳米结构，包括聚体、胶束、纳米凝胶和树突状膜囊泡，可以通过疏水力、静电相互作用或自组装的方式制备，每种结构都展示了增强mRNA递送的独特机会。

阳离子含胺的聚乙烯亚胺（PEI）已被广泛用于封装和递送核酸载荷，因其具有高封装和内体破坏能力。然而，高分子量PEI的过度毒性和低分子量PEI的低转染效率严重限制了其临床应用。为此，研究人员探索了化学修饰以克服这些挑战。例如，Zhao等人用硬脂酸修饰PEI（称为PSA），提高了其疏水性和自组装成阳离子纳米胶束。PSA在皮下注射后，高效递送HIV gag-1编码的mRNA至树突状细胞（DCs），并诱发全身免疫反应。在最近的一项研究中，我们的小组报告了一种多功能化策略，以提高阳离子聚合物的mRNA递送能力，包括线性和支化的PEI以及聚（氨基胺）（PAMAM）。合成了一系列含磷脂和烷基化的聚合物（PAPs），其中领先的候选者表现出比其未修饰的对照品高30,500倍的递送效能。这种聚合物单组分mRNA载体可以特异性递送mRNA至脾脏，并通过递送卵白蛋白（OVA）编码的mRNA疫苗表现出强大的抗肿瘤效能。

生物可降解聚合物，包括聚酯、聚（胺-酯）、聚（氨基酸）和聚（乳酸-羟基乙酸）（PLGA），代表了mRNA疫苗递送的有前景的替代品。通过理性的修饰，其性质可以轻松调整。聚（β-氨基酯）（PBAEs）通过胺含单体和二丙烯酸单体的迈克尔加成反应制备，具有在基因递送方面的几个公认优势，如易于制造、高生物相容性、单体可用性和结构灵活性。通过调整聚合物化学和拓扑结构，可以实现有效的和器官选择性的mRNA递送。例如，Yong等人构建了一个包含219种高度分支的PBAEs（HPAEs）的聚合物库，具有不同的骨架结构、末端基团和分支度。HPAEs的分支结构提供了增强的血清稳定性和显著更高的mRNA表达水平。同时，HPAEs的末端胺结构可以影响HPAE纳米颗粒在静脉注射后的器官亲和力：吗啉可以实现肝靶向，乙二胺可以促进脾靶向，而甲基戊烷则可以同时将mRNA递送至肝、脾和肺。PBAE基的载体已被广泛用于mRNA疫苗开发。例如，Green的小组筛选了超过200种PBAE三聚体，具有不同的基础聚合物结构、不同的侧链疏水性以及不同的末端单体，用于自我扩增mRNA（SAM）疫苗递送。结果表明，末端单体结构和脂质侧链的比例对递送效能至关重要，以低剂量递送SAM编码的狂犬病毒糖蛋白可产生显著的保护效果。Ben-Akiva等人设计了一系列含二硫键的疏水性生物可降解PBAEs，并研究了它们的结构-功能关系。脂质侧链长度对转染效能至关重要，表现最佳的候选者能够同时递送抗原和佐剂，用于治疗小鼠的黑色素瘤和结肠腺癌。

其他结构的混合载体也被报道具有独特的mRNA封装和递送特性。例如，Xu小组开发了一种脂质-聚合物混合粒子-粒子纳米结构基因递送系统。简而言之，PBAEs首先被修饰为疏水性脂质侧链，称为L-PBAEs。然后，L-PBAE基纳米颗粒被配方为PEG-PLGA载体，以创建“纳米颗粒储库”结构，从而提高转染效率、持续释放和稳定性。这种基于纳米结构的新冠疫苗在-20°C的冻干储存一年后，仍然表现出强大的Th1型免疫反应。Zhang等人报告了一种类似于胶束的纳米颗粒（MNPs）用于不同RNA药物的递送，包括抗原编码的mRNA。为了构建MNPs，RNA分子通过离子化脂质和阳离子脂质被疏水化，然后与两亲性聚合物共组装。封装OVA编码的mRNA的MNPs实现了有效的抗原呈递并表现出对OVA表达的黑色素瘤模型的高效抗肿瘤功能。

除了脂质和聚合物基载体外，其他载体也展示了在mRNA疫苗递送中的有效性。外泌体是天然来源的细胞外囊泡，直径为40–160纳米，由广泛细胞分泌。外泌体可以携带蛋白质和核酸，参与多种关键生理过程，运输物质并促进细胞-细胞通讯。由于其公认的低免疫原性、长循环、器官/组织亲和力和屏障穿透能力，基于外泌体的药物递送潜力已被确立。这些特性使外泌体在mRNA疫苗递送中具有吸引力。例如，Cheng的小组利用肺来源的细胞外囊泡（Lung-Exo）作为吸入式mRNA疫苗递送的载体。干粉Lung-Exos在室温下保持稳定，并与临床使用的干粉吸入器（DPI）设备兼容，适合家庭使用。与商业合成脂质体相比，Lung-Exos表现出更好的黏液穿透能力，提高生物利用度，增强在支气管和肺泡中的分布和保留，最终诱发更强烈的免疫反应。

病毒样颗粒（VLPs）是由病毒结构蛋白（如包膜蛋白和衣壳蛋白）组装而成的。尽管VLPs在大小、几何形状和内部结构上与自然病毒相似，但它们不含病毒基因组，这使VLP成为一种具有高安全性和免疫刺激效能的有前景的疫苗载体。例如，Karan等人开发了两种植物病毒衍生的VLPs，用于递送自我扩增mRNA：一种由豇豆黄化脉明病毒（CCMV）衣壳蛋白制成的球形VLP，以及一种由烟草花叶病毒（TMV）衣壳蛋白衍生的圆柱形VLP。在小鼠足垫注射后，这两种VLP诱导了在引流淋巴结中的显著mRNA表达。Yin等人设计了一种靶向DC的VLP（DVLP），其包被了经过工程化的辛德比斯病毒糖蛋白，该糖蛋白能够识别DC表面的特定蛋白。与LNPs和非靶向VLPs相比，DVLPs诱导的抗原特异性IgG生产提高了约一个数量级，并表现出更强大的T细胞反应，突显了VLP靶向特性的优势。

水凝胶由具有三维网络结构的聚合物系统组成，可以快速吸收和保留水分，同时保持结构完整性而不溶解。在药物递送应用中，水凝胶可以实现控制和持续的治疗载荷递送，允许共封装具有不同理化性质的药物以产生协同效应。Yin等人报告了一种可注射的水凝胶（GLP Gel）用于高效的局部mRNA疫苗递送。PEI和石墨烯氧化物（GO）被选择来制备GLP Gel，通过简单混合将抗原编码的mRNA和佐剂（R848）装载。在皮下注射后，GLP Gel能够将mRNA定向递送至淋巴结，并表现出至少30天的持续释放。此外，水凝胶可以调节局部免疫环境，为增强免疫反应和mRNA疫苗的疗效提供机会。例如，Meany等人设计了一个模块化的水凝胶储库平台，基于疏水性修饰的羟丙基甲基纤维素（HPMC-C12）与聚（乙二醇）-聚（乳酸）纳米颗粒（PEG–PLA NPs）之间的相互作用，以增强mRNA疫苗的疗效。水凝胶能够吸引各种免疫细胞类型，形成局部免疫小生境，通过改变封装的佐剂，可以简单调节细胞的微环境，这可能显著影响免疫反应。水凝胶能够有效促进商业化的SARS-CoV-2 mRNA/LNP疫苗的摄取和表达，从而增强体液免疫反应的广度和持续性。Zhu等人通过交联电纺聚（ε-己内酯）（PCL）纳米纤维碎片和透明质酸（HA）网络，制备了纳米纤维-水凝胶复合材料（NHC），然后将mRNA-LNPs纳入（称为LiNx）。LiNx促进了抗原表达、呈递和免疫对话。在三种测试的配方中，D6 LiNx能够诱导连续的宿主细胞招募和激活，导致强大的Th1、Th2和Th17反应。D6 LiNx表现出最显著的抗肿瘤效能，甚至与传统的三剂量方案相比。

无机材料通常较少用于制备mRNA疫苗载体，但它们的功能不同于有机材料。碳点（CDs）是一种独特的零维无机纳米材料，具有诸如光致发光特性、易于表面功能化和水分散性的优势。Chen等人优化了两亲性CDs作为mRNA疫苗载体。具体而言，通过一步溶剂热策略，用不同线性、分支或环状聚胺合成两亲性CDs。随后，将疏水链功能化到PA-CD表面以提高mRNA递送效能。筛选后，发现O12-Tta-CDs能够有效递送mRNA至脾脏并促进DC成熟。在E.G7-OVA肿瘤模型中，O12-Tta-CDs@OVA-mRNA能够有效抑制肿瘤生长并防止肿瘤复发。磷酸钙（CaP）是另一种无机材料，能够有效封装和递送mRNA，显示出在mRNA疫苗开发中的潜力。例如，Huang的小组设计了脂质包被的CaP纳米颗粒（LCPs）用于治疗性癌症疫苗的递送。核酸载荷与CaP共沉淀生成核心，然后用阳离子脂质和PEG连接的脂质包被。通过同时递送PD-L1 siRNA和酪氨酸相关蛋白（TRP）编码的mRNA，LCP基疫苗能够诱导强大的CD8+ T细胞反应和肿瘤抑制功能，在小鼠的B16F10黑色素瘤模型中。在另一项研究中，无机磷酸钙纳米颗粒被选择用于构建水-油-水（w/o/w）Pickering乳化（CaP-PME）用于mRNA疫苗递送。无机材料的掺入可以稳定乳化并增强抗原编码mRNA的细胞质递送。此外，CaP能够通过扰动细胞内Ca2+/K+离子平衡并促进IL-18分泌，激活DCs。因此，CaP-PME基mRNA疫苗能够同时激活CD8+ T细胞和自然杀伤（NK）细胞反应，有效缓解免疫抑制的肿瘤微环境。

为了提高mRNA疫苗的免疫刺激效能，一些研究集中于封装佐剂以增强免疫反应。例如，Islam等人用棕榈酸修饰R848，以提高其疏水性，然后将R848与mRNA共同封装到聚合物-脂质混合纳米颗粒中。在另一项研究中，超分子脂质纳米颗粒（SMLNPs）被设计用于共同递送抗原编码的mRNA和R848。通过使用β-CD修饰的脂质和离子化脂质N2-3L，R848通过主客体相互作用成功封装，并表现出持续释放。SMLNP@mRNA OVA有效地诱导了DC成熟，激活了细胞毒性CD8+ T细胞，并诱发了强大的抗肿瘤免疫。此外，一种混合纳米颗粒结构被报道用于共同递送TLR7激动剂gardiquimod和mRNA。PLGA核心被引入以封装水溶性gardiquimod，而mRNA分子被封装在外部脂质壳中。静脉注射后，mRNA和gardiquimod在脾脏中积累并表现出协同的免疫激活效应。

许多金属离子已被报道显示出先天免疫激活能力。锰离子（Mn2+）可以通过激活循环GMP-AMP合成酶-干扰素基因（cGAS-STING）通路来增强免疫反应并调节肿瘤微环境。为了利用这些特性，Song小组将Mn2+引入离子化脂质IC8基LNPs中，以构建SARS-CoV-2 mRNA疫苗。Mn2+与mRNA的摩尔比为1/1，通过增强内体逃逸来提高IC8/Mn LNPs的mRNA递送。Mn2+可以通过激活STING来发挥佐剂效能，从而导致抗原特异性抗体滴度升高和更强大的Th1型免疫反应。在另一项研究中，Luo等人将Mn2+掺入具有高封装效率的脾靶向LNPs中。阴离子磷脂1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸（DOPS）赋予LNPs选择性脾靶向能力，并实现了足够的Mn2+封装。静脉注射后，这种“一体化”LNP疫苗平台能够迅速诱导初始T细胞分化为记忆T细胞表型，并增加效应T细胞在肿瘤组织中的浸润。其他类型的金属佐剂也值得验证其在mRNA疫苗中的佐剂作用。

mRNA疫苗的佐剂共同递送方法提供了显著的灵活性。基于抗原载荷和疾病类型，佐剂可以被合理选择以满足特定的治疗需求。刺激不同TLR亚型的协同作用可以增强免疫反应。例如，由于体外转录的mRNA可以激活TLR7/8，PAM3CSK4（Pam3），一种TLR1/2激动剂，被封装到LNPs（Pam-LNPs）中，通过疏水相互作用。封装Pam3并未影响体内mRNA转染，同时在Pam-LNP治疗的小鼠中产生了更多的抗原特异性CD8+ T细胞和更高的TNF和IL-6水平。在另一项研究中，全反式视黄酸（ATRA）被封装到LNPs中，以提高mRNA疫苗对结直肠癌的治疗效果，同时克服ATRA的溶解性问题。ATRA的封装不仅提高了mRNA在脾脏APCs中的转染，还提高了细胞毒性T细胞的肠道归巢受体表达，包括CC基序趋化因子受体9（CCR9）和α4β7整合素。ATRA-佐剂的mRNA疫苗建立了强大的黏膜抗肿瘤免疫，提高了肠道固有层、肠系膜淋巴结和原位结直肠肿瘤中的CD8+ T细胞浸润，有效消除了小鼠中的原位结直肠肿瘤。

在mRNA疫苗的递送系统中，免疫刺激效能的增强是研究的重点之一。例如，Kranz等人构建了一个mRNA-脂质体（RNA-LPX）疫苗，并发现通过调整mRNA/脂质比例以获得负电荷，RNA-LPX可以精确有效地靶向脾脏中的APCs。此外，研究还发现，通过引入选择性器官靶向（SORT）策略，开发具有高预测性的器官和组织靶向LNPs。具体而言，将第五种成分，即SORT分子，加入传统的四组分LNP配方中。永久阳离子、阴离子和离子化阳离子SORT成分可以分别将mRNA转染靶向肺、脾和肝。此外，研究还发现，通过调整SORT分子的pH值和离子强度，可以改变LNPs的pH值，从而改变吸附在LNPs表面的蛋白质冠状体，以及随后与不同器官和细胞的相互作用。

纳米颗粒的大小是另一个重要的特征，它可以调节在不同给药途径后的生物分布和表达动力学。小于200纳米的纳米颗粒被报道能够被动扩散到淋巴引流中，而200到500纳米的颗粒可能需要局部DC摄取才能循环到淋巴结。在一项研究中，Di等人制备了不同大小的LNPs，并发现小于100纳米的LNPs在注射后在肝和淋巴结中分布更多，而较大的LNPs则在肌肉中积累更多。在一项静脉注射的例子中，Sasaki等人通过改变mRNA缓冲液中的盐浓度（0–400 mM）筛选了各种LNP大小，显示出200–500纳米的LNPs在体内对脾脏DCs的高效递送。通过控制组装过程中的pH值和离子强度，Hu等人制备了具有非同寻常大小范围的聚合物纳米颗粒（400–1000纳米）。平均大小为400纳米的聚合物颗粒在注射后表现出在脾脏中的高分布，并能高效递送mRNA至单核细胞。当抗原mRNA与CpG佐剂共同装载时，转染的单核细胞分化为抗原呈递的DCs，并显著增强抗肿瘤免疫，在B16-OVA癌症模型中。由于血液中单核细胞的丰富性，这种单核细胞靶向的疫苗方法在开发强大免疫反应方面表现出巨大的潜力。

纳米颗粒的化学结构可能通过影响其整体理化性质来改变器官亲和性，但其机制往往不明确。Johnson等人制备了两种结构相似的LNPs（5A2-SC8和3A5-SC14 LNPs），包括相同的pKa、体外递送效能和体内在肝中的积累。然而，这些LNPs在体内递送效能和对肝癌模型的治疗效果表现出显著差异，这归因于这些LNPs的蛋白质冠状体和子器官亲和性。总体而言，控制体内靶向疫苗递送仍然是一个具有挑战性但有趣的领域，深入理解靶向理据和影响因素对于开发新的治疗策略至关重要。Green小组合成并筛选了一系列PBAEs用于体外和体内的mRNA递送。在全身给药后，发现端基结构在决定靶向肝、肺和脾的能力中起主要作用。在个体器官层面，增加烷基侧链的疏水性可以提高转染效能，优化的配方表现出对肺的高效转染，展示了通过调整聚合物结构来绕过肝靶向的潜力。在CDs的情况下，选择聚胺和疏水链的长度提供了一种显著影响脾靶向能力的方法，促进了mRNA疫苗的递送。

靶向疫苗递送也可以通过优化LNP组成来实现。阴离子辅助脂质，如1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸（18PA）、硬脂酸和阴离子磷脂，已被用于改善LNP-mRNA疫苗的脾靶向性，对应于SORT策略的理据。磷脂酰丝氨酸（PS）是一种膜分子，可以被免疫细胞（如DCs和巨噬细胞）识别，PS暴露在凋亡细胞和包膜病毒上，以增加吞噬作用。因此，PS含有的磷脂可以被加入到LNP配方中作为靶向基团。例如，Luozhong等人将DOPS加入MC3基LNP配方中，命名为PS-LNP。PS-LNP表现出增强的脾脏和淋巴结选择性分布和转染，这主要是由单核细胞和吞噬细胞介导的，它们都作为APCs发挥作用。通过功能化PEG-脂质，Liu小组构建了超声波辅助的氟化PEG化LNPs（F-LNPs），以增强脾脏靶向的mRNA转染。在治疗性超声波暴露后，氟化PEG-脂质的快速脱落被诱导，导致细胞摄取、内体逃逸和在脾脏中更高的转染效能。F-LNPs可以特异性地将mRNA递送至脾脏APCs，表现出在B16F10癌症疫苗模型中的治疗益处。除了理性的设计，还报道了一种基于条形码的高通量方法来筛选一个大型LNP配方库，以识别在肌肉或静脉注射后的淋巴器官靶向LNPs。有趣的是，我们的小组挑战了四组分LNP配方，开发了一种单组分离子脂质基纳米颗粒，用于非肝靶向的mRNA递送。富含二次胺的脂质在脾脏靶向和递送效能方面优于其三次胺对应物。此外，这种单组分递送系统可以高效转染脾脏T细胞，显示出在免疫治疗和疫苗开发中的巨大潜力。

为了理性控制APC靶向能力，可以将具有内在亲和力的小分子结构通过共价连接或自组装的方式纳入载体结构中。例如，将三种单糖（葡萄糖、葡萄糖和半乳糖）与离子化脂质共价连接作为LNPs的第五种成分，称为甜LNPs（STLNPs）。其中，含有半乳糖的LNPs（STLNPs-Man）表现出强烈的淋巴结积累、DC靶向和激活，这是由于其与DC上的CD206的强相互作用。封装卵白蛋白编码的mRNA（STLNPs@mRNA OVA）的肿瘤疫苗表现出与LNPs@mRNA OVA相当的抗肿瘤免疫，仅需LNPs@mRNA OVA的五分之一剂量，证明了这种DC靶向系统的可行性。研究揭示了STLNPs-Man通过阻断CD206/CD45轴来下调细胞毒性T细胞上的免疫抑制分子CTLA-4表达，进一步激发细胞免疫。此外，Tang等人使用唾液酸（SA）修饰的胆固醇来改变LNPs，以改善DC靶向和mRNA疫苗的内体逃逸。SA修饰的LNPs通过与DC上的唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素-1（Siglec-1）相互作用，表现出快速的DC摄取，90%的LNPs在4小时内从早期内体逃逸，避免溶酶体降解。可裂解的PEG-脂质也被纳入LNPs中，以促进SA暴露，进一步促进DC靶向。在静脉注射或皮下注射后，SA修饰的LNP疫苗诱发了强烈的抗肿瘤免疫，并启动了肿瘤免疫循环，优于商业mRNA疫苗。

除了理性的设计，还报道了一种基于条形码的高通量方法来筛选一个大型LNP配方库，以识别在肌肉或静脉注射后的淋巴器官靶向LNPs。有趣的是，我们的小组挑战了四组分LNP配方，开发了一种单组分离子脂质基纳米颗粒，用于非肝靶向的mRNA递送。富含二次胺的脂质在脾脏靶向和递送效能方面优于其三次胺对应物。此外，这种单组分递送系统可以高效转染脾脏T细胞，显示出在免疫治疗和疫苗开发中的巨大潜力。

为了理性控制APC靶向能力，可以将具有内在亲和力的小分子结构通过共价连接或自组装的方式纳入载体结构中。例如，将三种单糖（葡萄糖、半乳糖和甘露糖）与离子化脂质共价连接作为LNPs的第五种成分，称为甜LNPs（STLNPs）。其中，含有甘露糖的LNPs（STLNPs-Man）表现出强烈的淋巴结积累、DC靶向和激活，这是由于其与DC上的CD206的强相互作用。封装卵白蛋白编码的mRNA（STLNPs@mRNA OVA）的肿瘤疫苗表现出与LNPs@mRNA OVA相当的抗肿瘤免疫，仅需LNPs@mRNA OVA的五分之一剂量，证明了这种DC靶向系统的可行性。研究揭示了STLNPs-Man通过阻断CD206/CD45轴来下调细胞毒性T细胞上的免疫抑制分子CTLA-4表达，进一步激发细胞免疫。此外，Tang等人使用唾液酸（SA）修饰的胆固醇来改变LNPs，以改善DC靶向和mRNA疫苗的内体逃逸。SA修饰的LNPs通过与DC上的唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素-1（Siglec-1）相互作用，表现出快速的DC摄取，90%的LNPs在4小时内从早期内体逃逸，避免溶酶体降解。可裂解的PEG-脂质也被纳入LNPs中，以促进SA暴露，进一步促进DC靶向。在静脉注射或皮下注射后，SA修饰的LNP疫苗诱发了强烈的抗肿瘤免疫，并启动了肿瘤免疫循环，优于商业mRNA疫苗。

为了理性控制APC靶向能力，可以将具有内在亲和力的小分子结构通过共价连接或自组装的方式纳入载体结构中。例如，将三种单糖（葡萄糖、半乳糖和甘露糖）与离子化脂质共价连接作为LNPs的第五种成分，称为甜LNPs（STLNPs）。其中，含有甘露糖的LNPs（STLNPs-Man）表现出强烈的淋巴结积累、DC靶向和激活，这是由于其与DC上的CD206的强相互作用。封装卵白蛋白编码的mRNA（STLNPs@mRNA OVA）的肿瘤疫苗表现出与LNPs@mRNA OVA相当的抗肿瘤免疫，仅需LNPs@mRNA OVA的五分之一剂量，证明了这种DC靶向系统的可行性。研究揭示了STLNPs-Man通过阻断CD206/CD45轴来下调细胞毒性T细胞上的免疫抑制分子CTLA-4表达，进一步激发细胞免疫。此外，Tang等人使用唾液酸（SA）修饰的胆固醇来改变LNPs，以改善DC靶向和mRNA疫苗的内体逃逸。SA修饰的LNPs通过与DC上的唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素-1（Siglec-1）相互作用，表现出快速的DC摄取，90%的LNPs在4小时内从早期内体逃逸，避免溶酶体降解。可裂解的PEG-脂质也被纳入LNPs中，以促进SA暴露，进一步促进DC靶向。在静脉注射或皮下注射后，SA修饰的LNP疫苗诱发了强烈的抗肿瘤免疫，并启动了肿瘤免疫循环，优于商业mRNA疫苗。

在mRNA疫苗的递送系统中，除了离子化脂质的理性和设计，还可以将具有毒性缓解特性的功能基团纳入LNP配方中。例如，Yang等人合成了一种脂质修饰的聚（鸟苷酸硫代乙酸）（L-PGTA）聚合物，以制备LNPs用于mRNA疫苗。L-PGTA中丰富的二硫键能够有效清除转染过程中产生的ROS，导致DC转染效能提高和系统性副作用减少。结合免疫检查点阻断，L-PGTA基的mRNA疫苗在小鼠中表现出强大的抗肿瘤效果。Song的小组报道了一种包被策略，将阳离子1,2-二油酰基-3-三甲胺丙烷（DOTAP）基的脂质体疫苗包被上阴离子聚合物，硫酸钠，形成SA@DOTAP-mRNA。这种策略赋予了更高的转染效能，这是由于内吞作用机制的改变和更有效的内体逃逸。此外，SA@DOTAP-mRNA表现出脾脏靶向性和更高的抗肿瘤免疫。阳离子脂质体的系统性毒性通过硫酸钠的电荷中和得到了显著缓解。

除了开发用于高度炎症LNPs的替代载体，Chen的小组还设计并筛选了一个包含26种离子化脂质的库。优化后的LNPs具有YK-201、YK202或YK-209的脂质，表现出在肌肉注射后的局部和持续mRNA表达。通过递送RSV-preFmRNA，这些LNPs表现出显著的体液免疫激活，并且优于商业SM-102基LNPs的安全性。此外，通过包被的PEG-脂质，可以促进SA暴露，从而促进DC靶向。在一项研究中，Feng等人开发了一种含有血清白蛋白结合基团的离子化脂质库，以利用血清白蛋白的自然循环路径。其中一种脂质，含有Evans蓝（EB），被发现能够增强淋巴结的积累，有效摄取DCs，并降低肌肉血流中的渗透。EB-LNP基的mRNA疫苗在体内表现出强大的Th1型免疫反应，并且在不同疾病模型中表现出优异的治疗潜力。

为了最大化疫苗的免疫反应，