利用单分子纳米孔传感技术量化RNA降解过程

《Analytical Chemistry》：Quantifying RNA Degradation with Single-Molecule Nanopore Sensing

RNA降解评估与固态纳米孔技术

　　RNA作为生命活动的重要分子，在众多诊断和治疗应用中扮演着关键角色。然而，RNA的化学不稳定性给研究人员和临床医生带来了诸多挑战。传统的凝胶电泳仍然是评估RNA降解的主要方法，但这种方法对RNA的用量要求较高，通常需要100纳克或更多。为了更深入地研究mRNA疫苗、病毒和细菌RNA以及其他有价值的RNA物种的降解情况，迫切需要开发更加敏感和定量的方法。本文介绍了一种利用固态纳米孔传感技术来评估不同条件下病毒RNA降解的新方法，实现了单分子级别的分析。这种方法在灵敏度上远超传统的电泳技术，甚至仅需约1皮克的RNA即可完成分析，适用于低丰度样本或高分子量RNA的降解研究。

在RNA检测和诊断领域，定量分析RNA分子至关重要。目前已有多种技术可用于检测特定的RNA，包括下一代RNA测序（RNA-seq）、微阵列检测以及逆转录定量聚合酶链反应（RT-qPCR）。这些方法通常依赖于目标RNA与互补链（如引物或探针）的杂交，以实现特定RNA的识别和定量。然而，为了使RNA发生杂交，往往需要先破坏其天然的二级结构，这通常通过热退火等过程完成。此外，PCR过程中反应体系常需维持在70-75摄氏度的高温下，以便聚合酶酶促反应的顺利进行。不幸的是，这些必要的加热步骤本身也可能导致RNA的降解。因此，研究RNA在不同条件下的自裂解行为对于优化现有的RNA检测技术和RNA基诊断方法具有重要意义。

RNA的降解途径多种多样，其中核糖核酸酶（RNases）是普遍存在的，能够以每毫克每分钟高达39纳摩尔的速度降解RNA。此外，RNA还容易受到活性氧物种的氧化作用影响。即使在严格控制的实验条件下，避免RNases和活性氧的干扰，RNA的磷酸二酯键仍可能通过转酯化反应断裂，这一过程也被称为RNA自裂解或自水解。这种断裂反应通常由酸性和碱性条件催化，且其速率受到RNA序列和反应条件（如pH值、温度和盐浓度）的影响。因此，对RNA自裂解行为的精确量化有助于深入理解其在不同环境下的稳定性，从而改进相关技术。

为了研究RNA的降解行为，本文采用固态纳米孔传感技术。该技术能够在不依赖荧光染料或引物的情况下，直接对任何已知或未知序列的单链RNA进行分析。相比传统的电泳技术，纳米孔传感具有更高的灵敏度，能够检测到皮摩尔级别的RNA分子。这一特性使得纳米孔传感技术在分析低丰度RNA样本时具有显著优势，尤其适用于临床相关的核酶或RNA疫苗等高价值样本。在实验过程中，研究人员对RNA样本进行了严格的无RNase处理，以确保其稳定性。此外，纳米孔传感技术还能直接计数RNA片段，从而构建出RNA降解的单分子图像。

在实验中，研究人员利用固态纳米孔对MS2病毒RNA进行了分析。MS2病毒RNA的长度为3.6千碱基，与许多具有诊断和治疗价值的mRNA相似。例如，用于新冠疫苗的mRNA长度约为3.8千碱基。MS2 RNA是从罗氏公司购买的分析标准品，并在收到后立即分装并保存于-80摄氏度以确保其尽可能未被降解。在整个实验过程中，该样本被称作“未处理RNA”。然而，生物系统本质上具有异质性，因此即使在严格控制的条件下，某些RNA降解也是不可避免的。

纳米孔传感技术的核心在于其能够通过测量电流变化来识别RNA分子。在实验中，研究人员使用了石英玻璃纳米孔，直径在10-15纳米之间。纳米孔将两个充满离子溶液的腔室隔开，RNA样本被引入其中一个腔室后，通过施加电压使离子通过纳米孔，同时记录电流变化。RNA分子因带负电荷而被电场驱动穿过纳米孔，从而引起电流的暂时下降。通过分析这些电流下降的深度和持续时间，研究人员可以推断RNA分子的长度和完整性。

在理想情况下，未处理的RNA分子应具有相同的长度，从而在纳米孔中产生单一的电流阻断信号。然而，由于RNA的构象灵活性，即使长度相同的RNA分子也可能表现出不同的电流阻断深度。当RNA发生降解时，电流阻断信号会变得更加异质化，出现较浅的信号，这些信号对应于RNA片段。通过将实验数据与理论模型进行对比，研究人员能够区分不同长度的RNA分子，并量化降解的程度。这种方法在某些情况下甚至可以检测到比纳米孔检测阈值更小的RNA片段，从而减少对高度降解样本的不确定性。

在实验中，研究人员还探讨了不同单价阳离子对RNA降解的影响。他们选择了锂离子（Li?）、钠离子（Na?）和钾离子（K?）作为测试对象，并在相同的pH条件下（8.0）进行比较。锂离子在固态纳米孔领域被广泛使用，因其能够有效减缓DNA和RNA的迁移速度，从而提高分辨率。相比之下，钠离子和钾离子在DNA/RNA纳米技术中常用于折叠复杂结构，如DNA折纸。实验结果表明，锂离子显著加速了RNA的自裂解过程，其降解速率是钠离子和钾离子的三倍。这一发现与之前的研究结果一致，即在锂离子存在下，肝炎delta病毒核酶的自裂解速率显著提高。此外，另一项研究指出，锂离子的半径可能是影响核酶活性的重要因素，这与本文中钠离子和钾离子表现出较慢的降解速率相符。

值得注意的是，即使在没有盐的条件下，仅使用Tris缓冲液，RNA的降解仍然发生。这表明，某些非离子性因素也可能影响RNA的稳定性。为了进一步验证纳米孔传感技术的有效性，研究人员还使用Agilent TapeStation系统进行了定量电泳分析，并计算了不同条件下的RNA完整性和半衰期。结果表明，纳米孔传感方法能够准确反映RNA的降解情况，尤其在锂离子条件下，其半衰期明显短于钠离子和钾离子条件。这一差异可能是由于纳米孔方法直接计数RNA片段，而电泳方法则依赖于荧光信号的强度，从而导致测量结果的不一致。

此外，研究人员还测试了在更高温度（94摄氏度）下RNA的降解情况。在PCR过程中，高温变性步骤通常用于分离DNA或RNA的双链结构，使其能够与引物结合。然而，这一过程也可能加速RNA的自裂解。实验结果表明，在94摄氏度下，RNA的降解速率显著提高，特别是在锂离子条件下，其半衰期仅约为7分钟。这进一步说明，高温变性步骤应尽可能缩短，以减少RNA的降解风险。

对于二价阳离子，如镁离子（Mg2?），其对RNA的影响更为复杂。二价阳离子能够通过与特定沟槽结合，稳定RNA的二级和三级结构，从而影响其自裂解行为。实验结果表明，与锂离子相比，镁离子对RNA的自裂解作用更为显著，其降解速率大约是锂离子的100倍。即使在仅1分钟的70摄氏度处理下，含有镁离子的RNA样本几乎完全被降解，这表明二价阳离子在RNA处理过程中应谨慎使用，以避免不必要的降解。

综上所述，本文通过固态纳米孔传感技术，成功实现了对RNA自裂解行为的单分子级定量分析。该方法不仅在灵敏度上显著优于传统的电泳技术，而且能够在不依赖引物或荧光染料的情况下，直接检测RNA的完整性。实验结果表明，纳米孔传感技术适用于高分子量RNA的分析，并能够准确评估不同条件下的RNA降解情况。这种方法为RNA稳定性研究提供了新的工具，特别是在分析mRNA疫苗、病毒和细菌RNA等具有重要诊断和治疗价值的RNA分子时，纳米孔传感技术展现出巨大的应用潜力。此外，该技术所需的样本量极低，仅为传统电泳方法的约1000分之一，这使其在处理低丰度样本时具有明显优势。未来，该技术有望在RNA基诊断和治疗研究中发挥更大作用，特别是在需要精确评估RNA稳定性的情况下。