N′-(1-苯基乙叉)苯腙的细胞毒性不依赖于赖氨酸特异性去甲基酶1（Lysine-Specific Demethylase 1），并与尤因肉瘤（Ewing Sarcoma）中铁硫簇（iron–sulfur cluster）的破坏有关

《ACS Pharmacology & Translational Science》：N′-(1-Phenylethylidene)benzohydrazide Cytotoxicity Is Lysine-Specific Demethylase 1 Independent and Linked to Iron–Sulfur Cluster Disruption in Ewing Sarcoma

该研究通过CETSA-MS和基因组学方法，揭示了LSD1抑制剂SP-2509/SP-2577在Ewing肉瘤中通过破坏Fe-S簇蛋白稳定性（如UQCRFS1、NDUFS1）和铁代谢途径，导致细胞死亡和抑制EWSR1::FLI1转录活性，其机制与LSD1抑制无关，且其他类似结构化合物（如15、19、20）同样表现出此类效果。

　　SP-2509和SP-2577是两种具有特殊作用的化合物，它们属于N'-(1-苯乙基)苯肼类分子，被发现对Ewing肉瘤有显著的治疗效果。尽管这些化合物最初被识别为LSD1（一种特定的赖氨酸去甲基化酶）抑制剂，但它们的疗效似乎与传统的LSD1抑制剂有所不同，后者在Ewing肉瘤治疗中效果有限。因此，科学家们开始探索SP-2509和SP-2577可能的非靶向机制，以解释它们为何在Ewing肉瘤中表现出独特的活性。

研究发现，这些化合物可能通过影响线粒体功能，导致细胞死亡。更具体地说，它们能够破坏依赖铁硫（Fe-S）辅因子的线粒体蛋白的稳定性，尤其是电子传递链复合体III的蛋白UQCRFS1。这种破坏可能是由于Fe-S辅因子结合能力的丧失，从而影响了线粒体的功能，进而导致细胞死亡。通过使用化学和遗传工具，研究者发现SP-2509引起的细胞死亡并不依赖于LSD1的抑制，而是与另一种核心结构——N'-(2-羟基苯基)苯肼有关。这表明，SP-2509的作用机制可能与铁代谢的改变有关，而非其对LSD1的直接抑制。

此外，研究还发现，SP-2509不仅影响UQCRFS1，还广泛破坏其他依赖Fe-S辅因子的线粒体蛋白。这一发现通过多种实验手段得到了验证，包括使用细胞热移位分析（CETSA）结合质谱分析（MS）以及Western blot技术。这些实验结果显示，SP-2509能够导致多个Fe-S蛋白的稳定性下降，并且这种影响在细胞处理一段时间后变得更为显著。例如，在处理24小时后，UQCRFS1和NDUFS1的蛋白水平显著减少，而CYC1（一种含血红素辅因子的蛋白）则未受影响，这进一步支持了SP-2509对Fe-S辅因子蛋白的特异性影响。

研究还探讨了铁和铜在SP-2509作用中的可能角色。尽管铜离子载体如elesclomol已被报道与铜离子相互作用，导致Fe-S蛋白的破坏和细胞死亡（称为铜诱导的细胞死亡，cuproptosis），但SP-2509似乎不直接依赖于铜。相反，研究发现铁的补充能够减轻SP-2509的毒性作用，而铜的补充反而增强了其效果。这表明SP-2509可能通过影响铁的生物利用度来发挥作用，而非直接与铜结合。

为了进一步验证这些发现，研究者还测试了其他含有相同N'-(2-羟基苯基)苯肼核心结构但不具有LSD1抑制活性的化合物，如化合物15、19和20。这些化合物在Ewing肉瘤细胞中表现出与SP-2509相似的细胞毒性作用，并且同样导致Fe-S蛋白的破坏。这表明，SP-2509的细胞毒性作用与LSD1的抑制无关，而是由其核心结构引起的，这一核心结构可能影响铁硫辅因子的生物合成过程。

此外，研究还探讨了这些化合物对基因表达的影响。通过RNA测序分析，发现SP-2509能够逆转EWSR1::FLI1融合蛋白的转录活性，而这一效果似乎不依赖于LSD1的抑制。这可能意味着，这些化合物通过破坏Fe-S辅因子的生物合成，间接影响了EWSR1::FLI1的功能。进一步的分析表明，这种影响可能涉及多个基因表达模块的改变，包括与蛋白质分泌、缺氧反应、血红素代谢和未折叠蛋白反应（UPR）相关的基因。

研究还发现，SP-2509的细胞毒性作用在不同细胞系中表现出一定的差异。例如，在A673细胞中，SP-2509的半数抑制浓度（IC50）较低，而在其他细胞系如HEK293和MG63中，IC50较高。这表明，细胞类型可能影响SP-2509的效力，某些细胞可能具有更强的补偿机制或更多的Fe-S蛋白储备，从而能够更好地耐受SP-2509的处理。

这些发现不仅揭示了SP-2509和SP-2577在Ewing肉瘤中的作用机制，还提出了关于如何将这些化合物转化为临床应用的新的问题。例如，如何理解EWSR1::FLI1的转录调控与Fe-S生物合成之间的关系，如何确定细胞死亡的精确机制，以及哪些生物特征使得某些癌细胞对SP-2509更敏感。这些问题对于未来的研究和临床转化至关重要。

在方法学方面，研究者采用了多种先进的技术，包括CETSA-MS、Western blot、RNA测序和酶活性检测。这些方法的结合使得研究能够全面评估SP-2509对细胞蛋白稳定性、基因表达和代谢途径的影响。例如，通过CETSA-MS，研究者能够检测到不同温度下蛋白的热稳定性变化，从而识别出可能的靶标蛋白。而通过RNA测序，研究者能够分析基因表达的变化，揭示SP-2509对细胞转录调控的影响。

这些研究结果为理解SP-2509和SP-2577的作用机制提供了新的视角，并为开发新的抗癌药物提供了潜在的靶点。研究还强调了在药物开发过程中，考虑非靶向作用的重要性，因为这些作用可能对药物的疗效和安全性产生重大影响。此外，研究结果还提示，针对特定癌细胞类型的铁硫辅因子生物合成的干扰可能是一个有前景的治疗策略，尤其是在那些依赖EWSR1::FLI1转录调控的癌症中。

总的来说，这项研究揭示了SP-2509和SP-2577在Ewing肉瘤中的作用机制，并提出了进一步研究的方向。这些发现不仅有助于理解这些化合物的生物学作用，还可能为开发新的抗癌药物提供理论基础和实验依据。