Bioorthogonal Probe BTD-Az 实现了蛋白质半胱氨酸磺基化的敏感且快速的体内分析

《Bioconjugate Chemistry》：Bioorthogonal Probe BTD-Az Enables Sensitive and Rapid In Vivo Profiling of Protein Cysteine Sulfenylation

氧化应激相关蛋白半胱氨酸磺酰化（Cys–SOH）动态调控及其在骨关节炎中的机制研究。开发新型细胞穿透探针BTD-Az，结合SPAAC点击化学和4D-DIA质谱技术，实现体内磺酰化组学分析。在老年小鼠关节软骨中发现IDH2 Cys–SOH修饰水平升高，导致其稳定性下降，形成氧化应激正反馈循环，加速软骨退变。研究为骨关节炎的早期诊断和靶向治疗提供新策略。

　　本研究围绕一种名为BTD-Az的新型化学探针展开，旨在解决细胞内半胱氨酸硫氧酸（Cys–SOH）这一易变、短暂且低丰度的翻译后修饰（PTM）在体内的动态检测难题。Cys–SOH作为一种红ox敏感的修饰形式，是半胱氨酸残基在活性氧（ROS）作用下被氧化为硫酚酸（–SOH）的过程，广泛参与蛋白质功能调控、细胞应激反应及信号传导等关键生物学过程。然而，由于其半衰期极短（约5分钟），传统的检测手段难以捕捉其在活体中的真实动态变化，限制了对其在疾病发生机制中的深入研究。因此，开发一种能够在体内快速、特异性地识别Cys–SOH的探针成为亟需解决的问题。

为了克服上述挑战，研究团队设计并应用了BTD-Az探针，该探针基于苯并噻嗪骨架，并引入了叠氮基团，使其能够通过应变促进的叠氮-炔烃环加成反应（SPAAC）实现生物正交标记。这种策略不仅简化了标记流程，还显著提高了标记效率和特异性，使得在体内外均能有效捕捉Cys–SOH修饰的蛋白质。在体外实验中，BTD-Az探针在30分钟内即可完成对多数蛋白质的标记，并通过与生物素偶联的磁珠进行高效富集，为后续的蛋白质组学分析提供了可靠的数据支持。而在体内实验中，该探针能够直接对小鼠组织中的Cys–SOH进行标记，且未表现出明显的细胞毒性，表明其具有良好的生物相容性。

研究进一步利用BTD-Az探针结合4D-DIA蛋白质组学技术，对年轻和年老小鼠关节软骨中的Cys–SOH修饰蛋白质进行了全面分析，共鉴定出超过5000个被标记的蛋白质。通过对这些蛋白质的差异分析，研究发现有95个蛋白质在年老软骨中表现出显著的硫氧酸修饰变化，其中IDH2（异柠檬酸脱氢酶2）的Cys–SOH修饰尤为引人关注。IDH2是一种关键的线粒体酶，参与三羧酸循环（TCA cycle），在维持细胞代谢平衡和抗氧化功能中起重要作用。然而，研究发现，随着年龄增长，IDH2的Cys–SOH修饰水平显著上升，而其总蛋白丰度却下降，这表明硫氧酸修饰可能通过影响IDH2的稳定性，进一步加剧了氧化应激的积累，从而形成一个恶性循环，推动软骨退化和骨关节炎（OA）的发展。

为了进一步验证这一假设，研究团队通过体外实验模拟了氧化应激环境，使用H?O?刺激SW1353细胞，并结合蛋白酶体抑制剂MG132和抗氧化剂NAC进行干预。实验结果显示，在H?O?刺激下，IDH2的表达水平下降，而其Cys–SOH修饰水平上升，且在MG132和NAC的共同作用下，IDH2的表达水平得以恢复，同时其Cys–SOH修饰也相应减少。这表明，氧化应激通过增加IDH2的Cys–SOH修饰水平，降低了其稳定性，从而导致其蛋白水平下降，并进一步促进ROS的积累，形成一个正反馈机制。这种机制可能在年老软骨中起到关键作用，加速了软骨退化和骨关节炎的病理进程。

除了IDH2，研究还发现其他多种蛋白质在年老软骨中表现出显著的硫氧酸修饰变化。通过GO（Gene Ontology）和KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）通路分析，这些蛋白质主要涉及细胞外基质的降解、炎症反应、线粒体功能、脂肪酸代谢以及胶原蛋白合成等生物学过程。例如，某些硫氧酸修饰的蛋白质在细胞外空间和细胞膜上富集，提示其可能在细胞与外界环境的相互作用中发挥重要作用；而另一些则在细胞内结构中富集，可能影响细胞内部的信号传导和代谢调控。这些发现不仅揭示了Cys–SOH修饰在衰老相关疾病中的广泛参与，还为理解其在骨关节炎发生发展中的具体机制提供了新的视角。

值得注意的是，尽管Cys–SOH修饰的蛋白质在体内具有重要的生理功能，但目前针对该修饰的检测手段仍存在一定的局限性。传统的检测方法如荧光成像、抗体检测和化学探针标记虽然在一定程度上能够揭示Cys–SOH的动态变化，但在分辨率、灵敏度和特异性方面仍难以满足高通量研究的需求。而BTD-Az探针的引入，不仅解决了这些问题，还为研究者提供了一种全新的、高效的工具，能够快速、特异性地捕捉Cys–SOH修饰的蛋白质，并通过质谱分析进行精确鉴定。这种技术的突破使得对Cys–SOH修饰的系统性研究成为可能，尤其是在探讨其在衰老、癌症和退行性疾病中的作用时，具有重要的应用价值。

此外，研究还探讨了Cys–SOH修饰在不同细胞器中的分布特征。例如，在体内实验中，BTD-Az探针的荧光信号主要集中在细胞的线粒体区域，这与线粒体作为ROS的主要来源密切相关。同时，该探针还能够在细胞核内的核仁区域检测到Cys–SOH修饰的信号，表明该修饰不仅限于线粒体，还可能在其他细胞结构中发挥重要作用。这一发现为理解Cys–SOH修饰在不同细胞亚结构中的功能提供了新的线索，也为后续研究不同细胞器中该修饰的动态变化奠定了基础。

在实际应用方面，BTD-Az探针不仅适用于基础研究，还具有潜在的临床价值。通过结合4D-DIA蛋白质组学技术，研究团队能够在不同年龄组的小鼠软骨组织中识别出差异表达的Cys–SOH修饰蛋白质，从而揭示其在衰老相关疾病中的潜在作用。例如，IDH2的Cys–SOH修饰不仅影响其稳定性，还可能通过改变其抗氧化功能，进一步加剧细胞内的氧化应激水平，导致细胞功能紊乱和组织损伤。这一发现为开发针对IDH2的靶向治疗策略提供了理论依据，也为探索其他与Cys–SOH修饰相关的治疗靶点打开了新的思路。

然而，尽管BTD-Az探针在检测Cys–SOH修饰方面表现出色，但其仍存在一定的局限性。例如，该探针目前尚无法实现对Cys–SOH修饰位点的精确识别，这限制了对其分子机制的深入解析。因此，未来的研究方向之一是开发能够进行位点特异性分析的探针，以进一步揭示Cys–SOH修饰在蛋白质功能调控中的具体作用。此外，针对Cys–SOH修饰的治疗策略也仍处于探索阶段，特别是如何通过调控该修饰水平来干预骨关节炎的进展，仍需更多的实验验证和临床研究。

综上所述，本研究通过设计和应用BTD-Az探针，为Cys–SOH修饰的动态检测提供了一种高效、特异且具有生物相容性的方法。该探针不仅能够快速标记和富集Cys–SOH修饰的蛋白质，还能够结合高通量蛋白质组学技术，实现对体内硫氧酸修饰蛋白质的全面分析。研究结果表明，Cys–SOH修饰在衰老相关疾病的病理过程中具有重要作用，尤其是在骨关节炎的进展中，其通过影响关键酶如IDH2的稳定性，进一步加剧氧化应激，形成恶性循环。这些发现不仅拓展了我们对Cys–SOH修饰生物学功能的理解，也为相关疾病的早期诊断和精准治疗提供了新的研究工具和技术支持。未来，随着探针技术的不断优化和蛋白质组学方法的进一步发展，Cys–SOH修饰的研究有望在更广泛的生物学背景下取得突破性进展。