通过无标记电化学发光显微镜技术对单个活细胞中分泌的赖氨酰氧化酶活性进行空间可视化

《Chemical & Biomedical Imaging》：Spatial Visualization of Secreted Lysyl Oxidase Activity from Single Living Cells via Label-Free Electrochemiluminescence Microscopy

高分辨率电化学发光成像技术实时监测单细胞分泌酶活性，揭示亚细胞LOX介导的细胞外基质重塑模式与肿瘤迁移的关联。该方法通过LOX催化产生的过氧化氢放大发光信号，实现无标记的亚细胞分辨率空间活性成像，可动态评估药物抑制效果、解析细胞群体异质性及发现酶活性空间偏倚现象，为实体瘤侵袭机制研究提供新工具。

　　在癌症研究中，理解细胞外基质（ECM）的重塑过程对于揭示肿瘤的侵袭性和转移机制至关重要。细胞分泌的酶活性在这一过程中扮演着关键角色，因此，能够在单细胞层面进行空间分辨率的分析，对于深入研究肿瘤行为具有重要意义。本文介绍了一种无标记的电化学发光显微镜（ECL）方法，能够以亚细胞分辨率可视化单个肿瘤细胞分泌的赖氨酰氧化酶（LOX）活性。该方法将ECM中发生的酶促反应与ECL信号放大相结合，通过LOX生成的过氧化氢（H?O?）增强基于鲁米诺的ECL信号，无需外部标记即可实现酶活性的直接映射。这一平台能够实时监测LOX抑制动态，对乳腺癌细胞群体中的LOX活性进行表型分类，并可视化LOX分泌模式的不对称性，从而指导肿瘤细胞的迁移行为。这些能力为ECM驱动的肿瘤侵袭提供了机制性的见解，并突显了ECL成像在高通量单细胞分析中的应用潜力。

酶在细胞内的作用至关重要，它们不仅参与细胞代谢，还在信号传导过程中发挥关键作用。然而，除了细胞内酶外，一些特定的酶在细胞内合成后被分泌到细胞外，这些分泌酶在细胞外基质中催化化学反应，对多种生理过程具有深远影响。其中，LOX作为一种重要的细胞外胺氧化酶，能够催化胶原蛋白和弹性蛋白之间的共价交联，这一过程对于ECM的稳定性至关重要。在乳腺癌、结直肠癌和胰腺癌等肿瘤中，LOX的表达和活性升高与肿瘤进展密切相关。此外，LOX活性的增加通常伴随着患者生存率的下降，这可能与其在ECM重塑和促进肿瘤侵袭与转移中的作用有关。因此，LOX被认为是癌症治疗的重要靶点，推动了多种癌症类型的LOX抑制剂的研发。

然而，酶的功能最终取决于其活性，而非表达水平，因此，准确评估LOX活性对于药物开发和机制研究具有重要意义。传统的酶活性检测方法通常依赖于细胞裂解物或组织匀浆，但这些方法破坏了细胞完整性，导致无法获取单细胞或亚细胞层面的空间信息。事实上，酶活性在不同细胞之间存在差异，这源于翻译调控、翻译后修饰和蛋白质降解等机制。这些过程会影响酶的特性或数量，从而产生功能上的异质性。因此，直接在单个活细胞层面测量酶活性，有助于揭示生化变异性，并阐明细胞异质性的来源。目前，单细胞酶活性的监测主要依赖于专门的荧光探针，但这些方法存在诸多限制，如复杂的探针设计、长时间的标记过程以及可能干扰细胞正常功能。此外，由于分泌酶具有动态性，而荧光成像的时间分辨率相对较低，因此难以捕捉活细胞持续释放的酶活性。在非荧光方法中，光热成像虽然可以无标记地检测，但需要复杂的仪器设备，且缺乏化学特异性。扫描电化学显微镜则可以直接读取酶活性的电化学信号，但其在大范围成像和快速采集方面存在困难。因此，实现单细胞层面分泌酶（如LOX）的高空间分辨率动态量化仍是一个重大挑战。

为了克服这些限制，本文引入了一种无标记的ECL显微镜方法，用于在单个肿瘤细胞中解析LOX的酶活性。通过将MCF-7细胞培养在透明的氧化铟锡（ITO）电极上，并加入底物以在ECM中启动LOX催化反应生成H?O?，该系统能够通过电化学刺激，使自由扩散的鲁米诺衍生物（L012）产生局部的无标记信号，从而反映酶活性。通过分析细胞膜区域的ΔECL强度，可以提取出与酶特异性相关的信号，从而定量绘制单个细胞周围区域的LOX催化效率。这种方法不仅能够识别出单个细胞群体中的四种酶活性表型，还揭示了在肿瘤迁移过程中，LOX介导的ECM沉积在亚细胞层面存在偏倚。该方法具有快速、敏感和无标记的优点，为其他细胞外酶的活性映射以及评估LOX靶向治疗策略提供了广泛的应用前景。

在实验过程中，首先对ITO电极进行了清洗，并在其表面固定了一个硅胶O环作为反应室。随后，将MCF-7细胞接种在含有DMEM完全培养基的ITO电极上，进行48小时培养以确保细胞附着并促进ECM形成。为了建立酶活性成像系统，构建了一个三电极体系，其中ITO作为工作电极，铂丝作为对电极，银/氯化银（Ag/AgCl）电极作为参比电极。在成像之前，将培养基替换为含有L012的PBS溶液，以确保L012能够在生理条件下表现出良好的ECL性能。通过在工作电极上施加1.0至-1.0 V的电位，可以记录ECL基线图像，并在添加底物后再次进行电位切换以获取ECL信号图像。通过使用ImageJ对图像进行处理，将ECL信号图像减去基线图像并除以基线图像，可以获得ΔECL图像，该图像与酶活性直接相关。ΔECL信号的强度能够反映酶催化反应的效率，同时避免了内源性活性氧（ROS）和底物可及性带来的干扰，确保所测信号准确反映酶促反应。

在实验中，ΔECL信号呈现出围绕单个细胞的环形模式，这与LOX主要定位在ECM中的特性一致。相比之下，细胞内区域的ΔECL信号较弱，表明活性LOX几乎不存在于细胞膜上。这进一步支持了LOX在肿瘤进展中主要通过ECM重塑发挥作用，而非通过细胞内信号传导。此外，通过使用荧光探针DCFH检测ROS，验证了ΔECL信号确实来源于LOX催化反应。在对照组中，使用PBS代替底物后未检测到ΔECL信号，这表明信号依赖于LOX的催化活性。在相同浓度的底物下，未观察到显著的ECL强度变化（变化率<4%），这表明该方法的读数不受底物添加的影响。

在分析LOX活性的细胞间异质性时，采用ΔECL显微镜技术，对单个细胞的反应速率曲线进行了研究。由于H?O?的生成速率与ΔECL强度成正比，ΔECL信号可以作为反应速率的间接读数。通过测定10个随机选择的MCF-7细胞的ΔECL信号，得到了其对应的反应速率曲线。这些曲线表明，单个细胞分泌的LOX在底物浓度有限的条件下表现出不同的亲和力和催化能力。根据K0.5值（反映底物亲和力）和酶活性单位（U，反映催化能力），可以将细胞分为四种表型：高亲和力-高活性（HH）、高亲和力-低活性（HL）、低亲和力-高活性（LH）和低亲和力-低活性（LL）。其中，大多数细胞属于HL表型，表明它们在底物浓度较低时仍能保持较高的催化效率，但在饱和条件下则表现出较低的活性。HH表型的细胞则在低底物浓度下仍能维持较高的活性，这可能意味着它们在资源有限的环境下仍具有较强的ECM重塑能力。LH表型的细胞在高底物浓度下表现出较高的活性，但其低亲和力表明其侵袭性可能依赖于环境中的底物丰度，因此可能具有更强的侵袭能力，但对底物变化较为敏感。LL表型的细胞则表现出低活性和低亲和力，可能更类似于上皮细胞，表现出较低的侵袭性。这些差异反映了LOX活性在细胞群体中的功能异质性，某些细胞可能处于过渡或应激状态，如细胞周期阶段的变化、对微环境因素的适应或正在进行的ECM重塑。

为了进一步研究LOX活性的空间异质性，本文还分析了单个细胞周围不同区域的催化效率。通过在细胞周围10 μm宽的环形区域测量ΔECL信号强度，并将其转换为H?O?浓度，计算出每个细胞的KAS值（单位面积和时间内的H?O?生成量）。结果表明，即使来自同一细胞群体的20个随机选择的细胞，其KAS值也存在显著差异，范围从0.71到1.83 μM s?1 mm?2，这说明个体肿瘤细胞之间的LOX活性存在明显的异质性。为了探究这种异质性的空间机制，选择了三个代表性细胞进行分析：细胞a是孤立的，细胞b与相邻细胞接触但未直接接触，细胞c则与相邻细胞直接接触。通过极坐标变换，绘制了每个细胞周围不同区域的KAS值曲线。在孤立的细胞a中，其周围区域的KAS值波动在1 μM s?1 mm?2左右，但在顶点区域（细胞边界曲率较高的区域）下降了高达81%，这可能与ECM的硬度增加有关，而ECM硬度已被报道可以调节LOX活性。对于细胞b，尽管在明场图像中未与相邻细胞直接接触，但其ΔECL信号与相邻细胞重叠，表明可能存在合并的ECM区域。在潜在接触区域，KAS值达到1.5-1.8 μM s?1 mm?2，约为其他区域的两倍，这表明该区域的ECM重塑较为活跃。而细胞c在与相邻细胞直接接触的区域表现出KAS值在1.1-1.9 μM s?1 mm?2之间，进一步支持了LOX活性在细胞间相互作用和迁移过程中局部上调的观点。

这些亚细胞层面的KAS图谱为首次实现对细胞周围LOX分泌异质性的空间解析提供了证据。该方法揭示了LOX介导的ECM沉积在肿瘤细胞迁移中的空间偏倚，局部升高的LOX活性可能有助于肿瘤细胞的定向ECM重塑，为前进提供锚点和机械支持，而局部降低的活性可能有助于细胞的脱离。这些模式展示了空间偏倚的LOX分泌如何促进肿瘤细胞的侵袭行为。与传统的标记方法相比，本文的方法无需外源性探针，其无标记特性使得能够在活细胞中实时监测酶活性，这一优势使其非常适合用于细胞外酶活性的动态研究。

此外，本文还探讨了该方法在药物筛选中的应用潜力。LOX活性作为肿瘤纤维化的关键指标，代表了在实体瘤中调控间质重塑的重要治疗靶点。在药物筛选中，酶活性常作为治疗效果的重要评估标准。本文提出的无标记成像方法避免了外源性探针的干扰，能够直接评估酶的功能，为药物评价提供了有利的工具。通过使用不可逆竞争性LOX抑制剂β-氨基丙腈（BAPN），验证了该方法在评估药物反应性方面的有效性。BAPN通过阻止胶原链之间的共价交联，抑制LOX的活性。实验结果表明，BAPN处理后，细胞周围的ΔECL信号强度和面积均显著下降，表明LOX活性受到抑制。此外，即使考虑到BAPN对ECL发射的轻微抑制作用，其抑制效果仍显著优于传统的荧光方法。这是因为荧光方法（如Amplex Red检测）通常会产生累积信号，难以捕捉实时变化。相比之下，ECL信号具有瞬时性，能够在较短的时间尺度上反映酶活性的变化。结合电化学而非光学激发，ECL成像方法为酶活性评估提供了一种快速、高通量的策略。

在实际应用中，本文的方法不仅适用于LOX，还可扩展到其他氧化酶和酶系统，为研究与酶相关的病理生理过程提供了强大的工具。通过这种无标记、高分辨率的方法，研究人员能够更深入地理解肿瘤细胞如何通过ECM重塑影响其迁移行为，并为开发针对LOX的靶向治疗策略提供依据。这种方法的优势在于其快速性、高灵敏度和无需标记的特性，使得它能够在活细胞中实时监测酶活性的变化，从而捕捉到动态的生物学过程。此外，该方法的信号输出不受外源性探针的影响，避免了标记过程可能带来的干扰，提高了数据的可靠性。

综上所述，本文开发的单细胞酶活性成像方法基于鲁米诺/H?O?电化学发光系统，能够通过LOX催化反应产生的H?O?实现空间分辨的ΔECL信号映射。该方法具有无标记、高灵敏度和快速响应的特点，能够对单个细胞的酶活性进行动态分析。通过这一策略，研究人员不仅能够评估细胞对LOX抑制剂的反应，还能够揭示细胞群体中酶活性的异质性，并发现LOX活性在细胞周围区域的分布差异，从而为肿瘤细胞迁移机制提供新的见解。此外，该平台在其他氧化酶和酶系统的应用潜力也得到了展示，为药物筛选和酶相关病理生理研究提供了有力的工具。未来的研究可以进一步优化该方法，提高其空间分辨率和时间分辨率，以更好地捕捉细胞外酶活性的动态变化，并拓展其在多种癌症类型中的应用。