利用MALDI成像质谱技术对单价金属-螯合剂复合物和脂质进行单峰成像分析

《Journal of the American Society for Mass Spectrometry》：Unimodal Imaging of Monovalent Metal-Chelator Complexes and Lipids by MALDI Imaging Mass Spectrometry

单模态金属与脂质同步成像技术的研究

　　在生物体内，单价金属离子（M?）的精确调控对于维持正常的细胞功能至关重要。这些离子，尤其是钠（Na?）和钾（K?）的浓度，不仅影响电化学信号的传递，还在营养物质和废物的次级运输过程中发挥关键作用。当这些金属离子的稳态失衡时，可能会干扰这些机制，进而影响下游生物分子如脂质的代谢。因此，阐明金属离子丰度与相关生物分子分布之间的关系，有助于更深入地理解健康组织和疾病组织的生理特性。目前，用于生物金属分布成像的传统技术包括二次离子质谱（SIMS）、激光诱导耦合等离子体质谱（LA-ICP-MS）以及X射线荧光光谱（XRF），但这些方法主要局限于元素分析或分子碎片的检测，难以直接可视化更复杂的生物分子在相同或相似样本中的分布。相比之下，基质辅助激光解吸/离子化成像质谱（MALDI IMS）是一种能够有效绘制生物分子分布的强大工具，但其当前的应用尚无法检测组织中的金属离子。本研究提出了一种新颖的方法，通过引入金属螯合剂，使MALDI IMS能够实现对M?金属和脂质的同时检测。

金属离子在细胞内具有重要的生理功能，例如在维持细胞膜电位、神经信号传递和肌肉收缩等方面起着关键作用。此外，钠钾泵在细胞内外的主动运输中扮演核心角色，使钠和钾的浓度在细胞内和外保持动态平衡。这种动态平衡不仅支持电化学信号的传递，还影响细胞内的代谢活动，包括酶的活性和底物的代谢过程。一些酶，如β-半乳糖苷酶和磷酸果糖激酶（PFK），已被证明与钾离子有密切关系，而其他酶如支链氨基酸脱氢酶和肌苷单磷酸脱氢酶（IMPDH）在钾离子存在的情况下表现出更高的活性。IMPDH作为脂肪酸代谢中的关键酶，其活性受金属离子的影响，而这种影响可能间接改变下游代谢产物的分布，但这种潜在关系尚未被广泛探讨。因此，研究碱金属的浓度和分布，对于理解脂质代谢的变化具有重要意义。

随着研究的深入，越来越多的学者认识到金属组学在生物系统中的重要性。为了更全面地了解生物体内金属的摄取、分布及其在不同组织中的行为，研究人员已经采用多种先进的成像技术，如激光烧蚀-电感耦合等离子体质谱（LA-ICP-MS）、X射线荧光光谱（XRF）以及飞行时间-二次离子质谱（TOF-SIMS）等。这些技术在不同物种的生物组织中广泛应用，能够揭示金属与组织形态之间的显著相关性。然而，这些方法在检测金属的同时，往往需要与其他成像技术相结合，例如免疫组化（IHC）或MALDI IMS，才能更全面地理解金属离子与下游生物分子之间的间接关系。近期，Gorman等人通过结合多模态TOF-SIMS和MALDI IMS技术，成功地在诱导铁死亡的组织中观察到铁与脂质的共定位现象。同样，Wang等人利用LA-ICP-MS和IHC技术，研究了不同脑区中铜离子的摄取差异，揭示了与神经退行性疾病相关的潜在途径。Müller等人则通过微XRF分析和定量LA-ICP-MS以及IHC技术，展示了铁在小鼠器官中的空间分布，进一步深化了对铁代谢的病理理解。

尽管上述技术在研究生物金属分布方面具有强大的能力，但它们也存在一定的局限性。这些方法通常只能检测元素或分子碎片，而无法直接对其他完整的生物分子类别，如脂质进行同时分析。因此，为了获取关于其他生物分子的信息，研究人员需要将这些技术与另一种分析手段结合使用。这种多技术联用的方式不仅增加了研究的复杂性，还可能在数据采集过程中引入额外的误差。而多模态成像技术虽然可以提供更全面的金属组学信息，但这些工作流程通常需要在多个样本上进行多次实验，增加了实验的时间和成本。因此，开发一种单一技术，能够同时对金属和生物分子进行成像，将大大减少不同技术之间转换所带来的干扰，同时降低实验所需的设备成本，使更多的研究人员能够进行金属与脂质的同步分析。本研究提出了一种基于现有技术的创新方法，使MALDI IMS能够实现对螯合金属和内源性脂质的同时检测。

MALDI IMS作为一种成像质谱技术，具有在生物组织中研究生物分子分布的优势。然而，传统的MALDI IMS方法在检测金属离子方面存在一定的困难，因为金属离子通常难以被MALDI直接离子化。为了解决这一问题，Jin等人利用活体小鼠注射螯合剂的方法，成功地在组织中检测到铁-螯合剂复合物。本研究则提出了一种无需注射螯合剂的方法，通过将螯合剂均匀地涂覆在组织样本上，实现对内源性金属离子的检测。为了评估所需螯合剂的量，我们对不同密度的螯合剂进行了测试，并与未使用螯合剂的对照样本进行了比较。结果显示，随着螯合剂密度的增加，信号强度也随之提升，而未使用螯合剂的对照样本中信号几乎为零。因此，选择较高的螯合剂密度（HI）能够获得更显著的金属螯合信号。同时，我们还发现，在未进行矩阵重结晶的样本中，信号强度略有增加，但可能是因为螯合剂与金属离子之间的相互作用使得信号更加集中。

为了验证螯合剂对脂质信号的影响，我们对脂质检测的信号强度和分布进行了评估。我们比较了在不同螯合剂密度下，脂质信号的强度变化，并发现螯合剂的应用并未显著影响脂质的检测。在质量范围内（m/z 700-860）的脂质信号强度在对照样本和高螯合剂密度样本之间基本一致，表明螯合剂对脂质的检测没有产生明显的干扰。此外，我们还对特定脂质（如SM 34:1；O2）的分布进行了比较，发现螯合剂的应用并未导致脂质的显著位移或质量变化。这些结果表明，使用MALDI IMS同时检测金属和脂质是可行的，且螯合剂的沉积不会影响脂质的信号强度或分布。

为了进一步验证该方法在组织中的适用性，我们对组织中的金属螯合信号进行了解剖学分析。我们比较了螯合剂金属复合物的分布与组织形态之间的关系，并发现这些信号主要集中在肾小管的横截面，这与肾小管在过滤钠和钾离子方面的生理功能相吻合。在非重结晶样本中，螯合剂金属复合物的信号主要分布在玻璃载片上，而非生物组织中，这表明在未进行矩阵重结晶的情况下，信号可能更容易被检测到。然而，当进行矩阵重结晶后，螯合剂金属复合物的信号强度显著提高，并且在肾小管横截面和组织边缘处更为明显。这可能是因为重结晶过程提高了金属螯合复合物的离子化效率，从而增强了信号强度。尽管如此，重结晶也可能导致某些金属螯合信号的放大，从而增加对非目标金属的检测。

在对内源性钾和钠螯合信号的解剖学验证过程中，我们发现这些信号主要集中在肾髓质区域，而这一区域在组织中没有肾小球。这与肾小球中钾和钠离子的分布形成了对比，表明肾髓质是钠钾泵高度活跃的区域，负责将这些离子从血液中过滤出来。此外，我们还观察到钾螯合信号在肾髓质中的分布呈现轻微的梯度变化，从外髓质向内髓质逐渐减少，这可能与肾小管在过滤过程中从外髓质向内髓质逐步浓缩钠和钾离子的生理机制有关。而钠螯合信号则在肾髓质中较为均匀，这表明钠的分布可能在肾髓质中更为稳定。值得注意的是，在肾皮质区域，钠钾泵的活性远低于肾髓质，因此钠螯合信号在该区域几乎检测不到。这一结果进一步验证了该方法在组织中的适用性。

此外，我们还对特定细胞类型在肾髓质中的分布进行了分析，并发现这些细胞类型并未表现出与金属螯合信号相关的独特特征。这一结果表明，该方法在分析金属分布时，可能更依赖于脂质的分布作为参考。通过将金属螯合信号与脂质信号进行叠加，我们能够更清晰地观察到金属离子在组织中的分布。这种叠加方式不仅有助于确认金属离子的空间定位，还能够为未来研究提供更丰富的数据支持。同时，我们还发现，该方法在检测金属离子时，能够有效区分金属螯合信号与非目标信号，从而减少信号干扰。

综上所述，本研究提出了一种基于螯合剂的创新方法，使MALDI IMS能够同时检测内源性金属离子和脂质。通过使用机器人喷雾器实现螯合剂的均匀涂覆，我们能够在组织中形成稳定的金属螯合复合物，并利用MALDI IMS进行高灵敏度的检测。实验结果表明，该方法不仅能够有效检测金属离子，还不会对脂质的检测造成干扰。此外，通过优化螯合剂的密度和矩阵重结晶的步骤，我们能够进一步提高信号强度，使金属和脂质的分布更加清晰。这些结果为未来研究提供了重要的基础，也为开发更高效的生物金属成像方法提供了思路。随着技术的不断发展，相信这一方法将在更多生物组织中得到应用，并为理解金属离子与生物分子之间的相互作用提供新的视角。