AstraMEV（基于人工智能的多表位疫苗结构组装技术）用于对抗传染性支气管炎病毒

《Journal of Chemical Information and Modeling》：AstraMEV (AI-Guided Structural Assembly of Multi-Epitope Vaccines) Against Infectious Bronchitis Virus

AstraMEV平台通过整合56株IBV基因组数据，利用AI工具RFdiffusion和ProteinMPNN设计并优化多表位疫苗（MEV），验证了SmallTope和BigTope疫苗与chTLR4的稳定结合及免疫应答。

　　传染性支气管炎病毒（IBV）作为一种快速变异和遗传多样性极高的禽类冠状病毒，对全球养鸡业构成了持续的威胁。为应对这一挑战，研究人员开发了AstraMEV平台，这是一个结合了基因组筛选和人工智能技术的预测性结构免疫信息学工具，用于识别来自核衣壳蛋白（N）和刺突蛋白（S）中的保守性表位。随后，设计并优化了两种多表位疫苗构建体，SmallTope和BigTope，这些构建体通过使用AI驱动的方法，如RFdiffusion和ProteinMPNN，以提高结构稳定性和免疫原性。分子动力学模拟证实了这些构建体的稳定性以及其与鸡 Toll-like 受体（chTLR4）的有效结合。值得注意的是，泊松-玻尔兹曼计算揭示了一些计算得出的变体表位显著提高了结合焓，突出了关键的相互作用区域。我们的综合方法证明了利用计算免疫信息学进行靶向疫苗设计的可行性。这些发现突显了AstraMEV在下一代IBV疫苗设计中的强大潜力，以及在应对快速演化的病原体方面更广泛的应用前景。

IBV能够迅速在禽类群体中传播，尤其是在未接种疫苗的鸟类中，病毒可以长时间被排出，从而促进其在鸡群中的传播。因此，控制IBV面临严格的生物安全措施和统一的鸡群年龄等挑战。然而，疫苗仍然是增强鸟类免疫系统以管理IBV感染的关键。尽管存在许多针对IBV的新疫苗，但只有减毒活疫苗和灭活疫苗被商业化应用。然而，减毒活疫苗的免疫动力学特征和其在产蛋母鸡中的免疫反应仍然存在一定的理解不足。此外，商业化使用的IBV改良活疫苗可能带来风险，包括恢复致病性、与流行毒株重组以及对接种鸡造成组织损伤。因此，利用计算免疫信息学进行表位识别和疫苗设计对于解决这些问题至关重要。

在这一背景下，多表位疫苗（MEV）作为一种关键的治疗策略应运而生。MEVs是基于肽的疫苗，包含T细胞和B细胞表位（即多个抗原性蛋白片段通过连接氨基酸串联在一起），旨在激发强大的细胞和体液免疫反应。MEVs提供了一种对抗病毒感染的有效方法，通过激发全面的免疫反应。这些疫苗利用T细胞受体（TCR）识别的、由多个靶向抗原识别的MHC限制性表位。此外，MEVs表现出增强的免疫原性，因为它们包含多个病毒抗原性表位。MEVs还提供持久的免疫保护，减少了传统疫苗通常伴随的副作用。然而，要设计有效的MEV，选择合适的靶向抗原和它们的免疫主导表位是至关重要的。此外，开发适当的递送系统对于这些疫苗的成功也是必不可少的。因此，MEVs的效力在很大程度上取决于合适候选抗原和相关免疫主导表位的选择。

在这一过程中，AstraMEV平台通过整合机器学习技术，特别是RFdiffusion和ProteinMPNN，成功生成并筛选出一系列符合靶向支架并能呈现多个表位的多表位疫苗库。这一策略为设计结构稳定、功能有效的疫苗候选者提供了创新途径。通过将多个表位整合到单一肽中，并保持其天然抗原性二面角，MEV能够模拟多个表位，从而增强免疫原性。AstraMEV不仅旨在生成全面的MEV设计库，还显著减少了实验测试过程中寻找领先疫苗候选者的试错过程，从而加快疫苗生物制造的流程，并为每个设计的MEV提供结构层面的可解释性。总体而言，AstraMEV具有设计治疗干预措施以控制病毒病原体如IBV的潜力，这将对养鸡业、动物健康以及全球农业经济产生积极影响。尽管AstraMEV是为IBV设计的，但其作为范例的重要性远大于其作为研究终点的局限性，因为AstraMEV协议是通用的，可以用于设计任何病毒病原体的MEV，前提是了解病毒基因组和宿主受体蛋白。我们已经报告了AstraMEV的β版本，用于设计稳定的免疫原肽，这些肽将多个PRRSV（感染猪群的猪繁殖与呼吸综合症病毒）的表位连接在一起。

在研究方法部分，本研究涵盖了疫苗表位的选择，如图1所示。随后是MEV的构建、质量评估和生化分析。我们利用预训练的深度学习技术（如ProteinMPNN、RFdiffusion、ESMFold、AlphaFold）来保持高度保守的表位，使用零样本方法（如图1所示）。

在预测T细胞表位方面，我们使用NetMHCpan 4.1进行MHC I类T细胞表位预测，使用NetMHCIIpan 4.0进行MHC II类T细胞表位预测。这些方法使用单抗原框架，可以整合来自公共领域的结合亲和力和质谱（MS）数据用于模型训练。这一方法具有最先进的性能，同时提升了预测能力。

对于NetMHCpan，我们包括了所有人类白细胞抗原（HLA）的代表性类型，使用默认参数，将强结合者的阈值设定在前0.5%排名，弱结合者的阈值设定在前2%排名。我们的分析专注于强结合表位。在NetMHCIIpan 4.0中，我们选择了人类白细胞抗原-DR beta（HLA-DRB）、HLA-DP和HLA-DQ的抗原类型进行表位预测。应用了默认标准，将强结合者的阈值设定在前1%排名，弱结合者的阈值设定在前5%排名。与我们在NetMHCpan中的方法一致，我们仅专注于强结合者。这种方法的严谨性确保了只有最有可能的表位被考虑用于进一步分析。

在预测B细胞表位方面，我们使用了BepiPred-3.0，这是一种能够准确预测线性和构象性B细胞表位的工具。我们将表位的百分比截断值设定在较高的置信度上，即前20%的表位。作为默认标准，预测B细胞表位残基的阈值设定在0.151（范围从0到1）。我们仅考虑了线性表位用于进一步分析。

在序列分析的保守性方面，我们使用了MAFFT（使用快速傅里叶变换的多重对齐）进行N和S蛋白的序列对齐和保守性分析。随后，我们使用IEDB表位分析工具包对这些对齐的序列中的表位进行全面分析。我们识别并选择了高度保守的蛋白区域进行深入分析。至少在45个N和45个S蛋白序列中出现的表位被选择，其中大多数残基超过90%的保守性。唯一的例外是两个S蛋白的B表位，其在45个序列中的保守性分别为84.44%和55.56%。这一筛选过程允许我们优先考虑具有最高保守性得分且显著重叠的表位。我们的方法产生了一组强大的表位，这些表位在主要IBV变体中广泛存在，为这种高度可变的病毒提供了广泛的覆盖。

在过敏性、抗原性和毒性分析方面，我们使用AllerCatPro 2.0评估了所识别的表位的过敏性潜力。AllerCatPro 2.0是一种先进的工具，可以预测蛋白质的过敏性及交叉反应性潜力，结合了多样化的蛋白质特性和临床相关性。我们排除了所有表现出强或弱过敏反应证据的表位。我们使用VaxiJen 2.0服务器预测了表位的抗原性诱导能力。VaxiJen 2.0是预测病毒免疫原性的黄金标准工具。将目标设定为病毒，默认阈值设为0.4，因为它在模型中表现出最高的准确性。接下来，使用ToxinPred 3.0预测了表位的潜在毒性。ToxinPred 3.0利用实验验证的有毒和无毒肽的大型数据集，以更高的准确性预测肽的毒性。对于此分析，我们应用了ET+MERCI混合机器学习模型，默认阈值设为0.38。默认阈值设定在有毒肽的截止值（0.5）以下，以确保保守的方法，并减少任何潜在有害序列的包括。最终，我们只选择了那些表现出无过敏反应、高抗原性诱导能力和无毒性的表位。

在构建SmallTope和BigTope疫苗时，我们从选中的258个表位中选择了23个具有最高保守性和重叠区域的表位，以维持多表位的大小在可接受的范围内，从而增强其免疫原性。在构建MEV时，我们采用了两种不同的方法。我们构建了SmallTope和BigTope作为我们的MEV（如表S2和数据S1所示）。SmallTope仅包含所有45个S和45个N蛋白中的最高保守区域，包含8个表位片段。这些表位针对MHC I类、MHC II类和B细胞受体。它们通过连接物连接在一起，以增强免疫原性，降低形成低可及性接头表位的风险，并增强目标表位的呈现。BigTope则被设计为包含约3倍更大区域的23个表位。表位组成如表1所示。

在设计MEV的稳定变体时，我们使用了RFdiffusion和ProteinMPNN进行变体的生成。我们利用基于扩散模型的RFdiffusion，创建了与对接的SmallTope和BigTope相关的结构骨架。在我们的设计过程中，我们保留了保守的连接物和佐剂。与chTLR4相互作用的残基（由初始对接研究中的6.5 ?截断值确定）被排除在扩散过程之外。我们将chTLR4中的相互作用残基指定为RFdiffusion的热点，以确保生成的结构能够保持与chTLR4的相互作用，类似于原始设计。使用这些参数，我们创建了50个结构骨架，部分扩散设置在20%。随后，为了优化SmallTope和BigTope的设计，我们使用ProteinMPNN，这是一种基于深度学习的蛋白质序列设计方法，为每个骨架生成10个序列。ProteinMPNN在传统方法上提供了更优的序列恢复和结构稳健性。这导致了每个疫苗构建体的500个序列变体。我们将温度参数设置为0.25（范围从0到1），在序列多样性与结构约束之间取得平衡。所有其他ProteinMPNN参数都保持默认值（如图2所示）。

我们生成了一组1000个MEV候选者，使用RFdiffusion和ProteinMPNN，包含500个变体每个用于SmallTope和BigTope。为了确保这些变体不是随机的，而是旨在改进初始的MEV，我们保留了原始的相互作用残基、佐剂和连接物。对于SmallTope和BigTope，允许96和206个残基进行氨基酸改变。最初，生成了50个蛋白质骨架，部分扩散设置在20%，以在序列变异与结构完整性之间取得平衡。随后，ProteinMPNN被用于为每个50个骨架生成10个序列，保留保守元素同时探索序列变异。

图5比较了这些变体与原始设计，揭示了新表位区域与chTLR4之间潜在的新相互作用。分析了1000个变体，发现多个潜在的相互作用在6.5 ?范围内（如数据S1所示）。SmallTope变体在MHC I类、MHC II类和B细胞表位区域分别显示出303、419和36个可能的相互作用，而BigTope变体在相应的区域显示出866、297和957个相互作用。总体而言，BigTope构建体在B细胞表位区域显示出显著增加的相互作用数量。这些变化突出了疫苗设计中的结构灵活性，其中原本非相互作用的表位在变体中变得相互作用，增强了我们设计的稳健性。序列相似性在SmallTope变体中范围从56%到70%，而在BigTope变体中跨度从48%到52%。值得注意的是，超过一半的变体显示出比原始MEV更高的结合能，同时保持相似的二级结构特征（如数据S1所示）。我们根据变体与原始设计的结构相似性以及HADDOCK对接的结合能进行排名。图5a,b展示了前50个变体，其中每个组的前五个表现者被选中进行进一步的分子动力学模拟。

总体而言，这一综合方法利用先进的计算方法生成和评估一系列MEV候选者，可能在改进原始设计的同时保持其核心结构和功能特性。AstraMEV平台的设计和应用不仅为疫苗设计提供了新的思路，也为未来的疫苗开发和应用提供了有力支持。