解码意大利青霉菌（Penicillium italicum）与柑橘之间的相互作用：非靶向代谢组学揭示了一种被忽视的采后病原体

《Journal of Agricultural and Food Chemistry》：Decoding the Penicillium italicum–Citrus Interaction: Untargeted Metabolomics Sheds Light on a Neglected Postharvest Pathogen

柑橘蓝霉病原菌Penicillium italicum与宿主的互作代谢研究显示，通过LC-HRMS和DESI-MSI技术鉴定出6种二酮哌嗪类生物碱，其中brevianamide F具有选择性抑制柑橘内生真菌Diaporthe sp.的生长作用，揭示其可能通过调节宿主微生物组平衡增强致病性。

　　柑橘蓝霉病是由青霉菌 *Penicillium italicum* 引起的一种重要贮藏期病害，严重影响柑橘品质和全球柑橘产量。为了深入理解该病害的分子机制，揭示病原体的致病性以及植物的防御反应，研究者采用了一种基于质谱的代谢组学和解吸电喷雾离子化质谱成像（DESI-MSI）方法，分析了柑橘与 *P. italicum* 之间的代谢相互作用。研究中鉴定出了一些关键的 *P. italicum* 产生的代谢产物，包括 12,13-脱氢脯氨酸色氨酸二肽、脱氧布维胺 E、脱氢脱氧布维胺 E、脱氧异阿斯特胺以及布维胺 F。为了评估这些代谢产物的生物学功能，研究者还合成并测试了布维胺 F 对柑橘相关内生菌的作用。结果显示，布维胺 F 可以选择性地抑制 *Diaporthe* 属的菌株，这表明 *P. italicum* 可能通过这种化合物调控内生菌群，从而在感染过程中占据优势。

柑橘作为全球重要的经济作物，其总产量高达 1.58 亿吨，其中甜橙的产量约占 78.7 万吨。微生物性采后病害是柑橘产业面临的主要挑战之一，可能导致高达 35% 的果实损失，并对全球经济造成严重影响。目前，主要的柑橘采后病害由 *Penicillium digitatum*、*Penicillium italicum* 和 *Geotrichum citri-aurantii* 等真菌引起，分别导致绿霉病、蓝霉病和柑橘酸腐病。其中，绿霉病在热带国家的采后损失中占比最高，可达 90%，而蓝霉病则在低温贮藏的果实中尤为常见。此外，蓝霉病具有“嵌巢”特性，即在同一批次的健康果实中迅速传播，造成更大的损失。在中国，蓝霉病是导致柑橘年产量损失的重要因素之一，占比在 33% 到 50% 之间。

蓝霉病的典型症状包括柑橘果皮组织中的果胶脱甲基化、细胞壁肿胀、细胞质分离以及早期感染阶段中 D-半乳糖醛酸的积累。为了深入研究病原菌与柑橘的代谢关系，研究团队对 *P. italicum* 的基因组进行了测序，发现其宿主范围比 *P. digitatum* 更广，能够感染多种水果，如牛油果、芒果、瓜类和苹果。然而，尽管 *P. italicum* 对水果生产造成了显著的经济损失，其生物合成潜力和致病因子仍鲜有研究。因此，了解其代谢产物及其作用机制对于开发新的病害防控策略具有重要意义。

目前，蓝霉病的防控主要依赖于合成杀菌剂，如嘧菌酯、咪鲜胺、氟硅唑和噻苯咪唑等。这些化学品虽然在短期内有效，但对环境和人类健康可能具有潜在毒性。此外，长期使用还可能导致病原菌产生抗药性、环境污染以及生态关系的改变。因此，研究者开始探索替代性的防控方法，包括电磁和离子化辐射、具有抗菌特性的精油和植物提取物、纳米技术以及有机和无机盐的使用，以及生物防治剂。然而，这些方法的防控效果尚未达到合成杀菌剂的水平。

为了更好地理解病原菌与宿主之间的生物化学途径和代谢产物的产生，研究者采用了一种非靶向代谢组学方法，分析了 *P. italicum* 引起的蓝霉病。该研究首次使用了超高效液相色谱-高分辨率质谱（LC-HRMS）和解吸电喷雾离子化质谱成像（DESI-MSI）技术，以探索病原菌在感染过程中产生的次级代谢产物，并监测柑橘的代谢防御策略。通过生物活性实验，进一步研究了这些代谢产物在蓝霉病中的生态作用。

在实验方法方面，研究者首先对 *P. italicum* 进行了培养，将其保存在西班牙类型菌株库（CECT）中，编号为 CECT20909。使用马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）作为培养基，经过高压灭菌后转移至培养皿中，进行接种并培养 7 天。随后，通过 Neubauer 计数器获取了 10^6 个孢子/毫升的孢子悬浮液。柑橘果实则从巴西坎皮纳斯的当地超市采购，并在 24 小时内进行处理，以减少采后操作带来的变异。所有果实均经过表面灭菌处理，使用 2% 的次氯酸钠溶液浸泡 5 分钟，随后用蒸馏水冲洗并晾干。在果实表面进行小切口，每个切口处施加 5 微升的 *P. italicum* 孢子悬浮液，并将接种后的果实放置于无菌容器中培养 10 天。在培养结束后，从感染部位取下果皮组织进行分析。

为了提取代谢产物，研究者将 1 毫升的甲醇加入 100 毫克的柑橘样品中，并在超声波浴中孵育 25 分钟。随后，通过离心分离代谢物，并使用氮气流干燥后重新溶解于 1 毫升的甲醇中。所有样品均经过 0.22 微米的 PTFE 滤膜过滤后保存。质量控制（QC）样品则通过收集 10 微升的每个样品至同一容器中进行制备。这些样品随后被分析，使用 Thermo Fisher RSLCnano U3000 超高效液相色谱仪和 Q-Exactive Orbitrap-MS 质谱仪进行检测，以获取详细的代谢信息。

在数据分析方面，原始数据文件被转换为 .mzXML 格式，随后使用 MZMine3 软件进行处理。在处理过程中，应用了多种参数，包括平滑处理、稳定离子化、保留时间裁剪、最大峰数、最小连续扫描次数等。对于质谱参数，包括离子模式、绝对强度、噪声水平、最小峰高、质荷比（m/z）容忍度等。通过过滤，去除了溶剂空白特征，并保留了所有相关代谢物的检测信息。这些数据随后被导入 MetaboAnalyst 5.0 软件中，进行多元分析。采用主成分分析（PCA）和监督偏最小二乘判别分析（PLS-DA）方法，以识别感染与非感染组之间的代谢差异。通过 PLS-DA 模型，筛选出 VIP 值 ≥1 的差异代谢物，这些代谢物在感染过程中具有重要的生物学意义。

为了进一步研究代谢物的分子结构和分类，研究者使用了全球自然产物社会分子网络（GNPS）平台，结合分子网络分析方法，通过 MS/MS 信息构建分子网络。该方法能够将实验谱图与参考谱图进行比较，识别出相似的代谢物。通过 Cytoscape 软件对分子网络进行可视化，展示了不同代谢物之间的关联性。为了进一步确认某些代谢物的结构，研究者使用了化学合成的方法，并通过 RT 和 MS/MS 数据的对比，实现了对布维胺 F 的一级鉴定。这些代谢物的结构和功能通过多种方法进行验证，如图谱比对、化学合成和光谱分析等。

此外，研究者还对 *P. italicum* 在不同培养基中的次级代谢产物进行了研究，包括橙汁培养基、马铃薯葡萄糖培养基和葡萄糖酵母蛋白培养基。这些培养物在无菌条件下培养 7 天，随后通过液液萃取法分离代谢物，并使用 LC-HRMS 进行检测。该方法不仅能够识别代谢物，还能分析其在不同培养基中的变化情况，从而揭示其代谢特性。在 MSI 分析中，研究者首次将该技术应用于柑橘果实感染模型，对感染后的果实和未感染果实进行分析，以确定代谢物的空间分布。通过不同的样品处理方法，如直接分析和印模技术，研究者能够更精确地获取代谢物的空间信息。

在研究过程中，研究者还对柑橘果皮中的内生菌群进行了分离和鉴定。通过 IT 基因序列分析，结合系统发育分析，确认了两种内生菌的种类，分别是 *Colletotrichum* 属和 *Diaporthe* 属。这些内生菌的鉴定不仅有助于了解它们的生态功能，还为后续的相互作用研究提供了基础。在研究 *P. italicum* 与内生菌的相互作用时，研究者采用了共培养实验，以评估 *P. italicum* 对内生菌的抑制作用。实验结果表明，*P. italicum* 对两种内生菌均具有显著的抑制效果，分别降低了它们的生长速率 16% 和 21%。

在抗真菌实验中，研究者测试了布维胺 F 对 *Diaporthe* 属和 *Colletotrichum* 属内生菌的抑制作用。实验结果显示，布维胺 F 在最高浓度（0.3 mg/mL）下对 *Diaporthe* 属内生菌具有显著的抑制效果，而对 *Colletotrichum* 属内生菌则没有明显的抑制作用。这表明 *P. italicum* 可能利用布维胺 F 作为其抗微生物策略，以调控内生菌群。此外，研究者还通过共聚焦显微镜分析了布维胺 F 对 *Diaporthe* 属内生菌的生长影响，观察到其菌丝结构发生明显变化，这进一步支持了布维胺 F 的抗真菌潜力。

研究还探讨了柑橘果实中某些代谢物的生物活性，如 hesperetin 7-O-葡萄糖苷、naringenin 和 3′,5,7-三羟基黄酮等。这些代谢物在柑橘的抗病机制中发挥重要作用，可能作为宿主的防御反应的一部分。此外，研究者还分析了布维胺 F 的绝对构型，通过 Marfey 反应确认了其化学结构，并发现其含有 L-脯氨酸和 L-色氨酸作为其立体化学成分。这些发现不仅有助于理解 *P. italicum* 的代谢产物特性，还为开发新的病害防控策略提供了理论依据。

研究还指出，这些代谢物的积累可能与柑橘的抗病反应有关，如抗氧化和抗炎作用，可能帮助柑橘抵抗 *P. italicum* 的感染。此外，研究者还通过分子网络分析，发现某些代谢物可能在病原菌和宿主之间具有特定的代谢模式，这些模式可能与病原菌的致病性有关。通过这些研究，研究者不仅揭示了 *P. italicum* 与柑橘之间的代谢关系，还为开发新的病害防控策略提供了可能的方向。

综上所述，本研究通过整合代谢组学和质谱成像技术，首次系统地揭示了 *P. italicum* 在柑橘感染过程中的代谢产物及其空间分布，为理解病原菌与宿主的相互作用提供了新的视角。同时，研究者还验证了某些代谢产物的抗真菌活性，特别是布维胺 F 对 *Diaporthe* 属内生菌的抑制作用，这可能为未来开发基于自然产物的病害防控策略提供重要参考。这些研究不仅加深了对柑橘蓝霉病的了解，还为提升柑橘产业的可持续发展提供了科学支持。