血液制品预处理的Hoffa脂肪垫间充质干细胞外泌体在骨关节炎治疗中的抗炎与软骨保护作用研究

《Stem Cell Research & Therapy》：Extracellular vesicles from primed Hoffa’s fat pad mesenchymal stem/stromal cells in osteoarthritis therapy: effects on cells critical to osteoarthritis progression

本研究针对骨关节炎(OA)缺乏有效疾病修饰疗法的临床难题，探讨了Hoffa脂肪垫(HFP)来源间充质干细胞(MSC)外泌体(EV)经血液制品(PRP/HypACT)预处理后的治疗潜力。通过3D生物反应器培养、纳米颗粒跟踪分析(NTA)及共培养模型，发现HFP-MSC-EVs可显著下调软骨细胞中基质金属蛋白酶(MMP3/MMP13)和滑膜成纤维细胞中炎症因子(CCL5/COX2)表达，并促进抗炎因子IL-10释放。该研究为开发基于EV的无细胞疗法提供了新策略。

　　

骨关节炎作为最常见的退行性关节疾病，全球有数亿患者深受其苦。目前临床治疗主要以缓解症状为主，缺乏能够逆转疾病进展的有效手段。随着再生医学的发展，间充质干细胞(MSC)疗法为骨关节炎治疗带来了新希望。然而，细胞治疗存在免疫排斥、肿瘤形成风险等局限性。近年来，研究者将目光投向MSC分泌的细胞外囊泡(EV)——这种纳米级膜泡可携带母细胞的功能性分子，且具有更低的免疫原性，成为极具潜力的"无细胞治疗"新策略。

那么，如何获得治疗效能更优的EV呢？位于膝关节内的Hoffa脂肪垫(HFP)因其天然关节环境定位，其来源的MSC表现出比皮下脂肪或骨髓MSC更强的软骨分化能力。同时，临床常用血液制品如血小板富集血浆(PRP)和超急性血清(HypACT)已被证明可增强MSC功能。基于此，斯拉沃米拉·古洛娃(Slavomira Gulova)团队在《Stem Cell Research & Therapy》发表研究，创新性地将血液制品预处理与HFP-MSC来源EV相结合，系统评估了其对骨关节炎关键细胞的治疗效果。

研究人员采用垂直轮式生物反应器进行HFP-MSC的三维微载体培养，通过超滤法分离EV，并利用纳米颗粒跟踪分析(NTA)、Western blot等技术对EV进行表征。通过建立软骨细胞/滑膜成纤维细胞与M1巨噬细胞的共培养炎症模型，利用RT-qPCR、ELISA等方法评估EV对炎症反应、基质代谢的影响。特别探讨了阳离子聚合物polybrene对EV细胞内化的增强作用。

HFP-MSC-EVs的制备与表征

通过三维生物反应器培养系统，HFP-MSC在微载体上呈现良好的增殖活性。从经胎儿牛血清(FCS)、PRP或HypACT预处理的细胞上清中分离的EV，均表达典型标志物CD9、CD63和syntenin，且基本不含细胞(calnexin阴性)和血浆(ApoB100阴性)污染物。有趣的是，PRP预处理的EV样品中观察到高电子密度颗粒，提示可能存在PRP残留。荧光NTA分析显示CD9⁺EV的平均粒径(82.5nm)显著小于CD73⁺EV(161nm)，反映了EV亚群的异质性。

EV的内化效率提升但未增强疗效

采用CFSE标记EV后，通过共聚焦显微镜观察发现，polybrene可显著提高EV被软骨细胞和滑膜成纤维细胞的摄取量(分别从8.86个/细胞增至14.14个/细胞，以及从13.38个/细胞增至49.67个/细胞)。然而，这种内化效率的提升并未转化为治疗效果的显著改善，提示EV的生物学效应可能更依赖于其 cargo 组成而非单纯摄取数量。

HFP-MSC-EVs对炎症环境下软骨细胞的调节作用

在M1巨噬细胞诱导的炎症环境中，软骨细胞表现出细胞外基质降解酶MMP3、MMP13基因上调，以及Ⅱ型胶原(COL2A)基因下调。经HFP-MSC-EVs处理后，软骨细胞中MMP3和MMP13的表达显著降低，同时COL2A表达呈现上调趋势。值得注意的是，EV供体的年龄显著影响疗效：年轻供体来源的EV可显著促进COL2A表达，而老年供体来源的EV反而抑制COL2A表达。ELISA检测显示，EV处理组抗炎因子IL-10的释放量显著增加，且polybrene的存在会降低IL-10水平。

对滑膜成纤维细胞炎症反应的抑制

在滑膜成纤维细胞与M1巨噬细胞共培养模型中，HFP-MSC-EVs处理显著下调了炎症相关基因CCL5/RANTES和COX2的表达。同时，抗炎因子IL-10的分泌量明显增加，而促炎因子TNF-α水平无显著变化。这表明EV可能通过调节滑膜细胞的炎症状态来缓解关节滑膜炎。

巨噬细胞表型转换的诱导

在共培养体系中，HFP-MSC-EVs处理显著提高了巨噬细胞中IL-10的基因表达水平。IL-10是M2型巨噬细胞的标志性抗炎因子，这一结果提示EV可能促进M1向M2表型转化，从而发挥免疫调节作用。

血液制品预处理的影响

尽管PRP和HypACT预处理提高了EV的产量，但三种预处理方式(FCS、PRP、HypACT)的EV在调节靶细胞基因表达和蛋白分泌方面未表现出显著差异。这可能与预处理时间较短(24小时)有关，延长预处理时间或许能更有效地"赋能"EV。

本研究首次综合评估了血液制品预处理的HFP-MSC-EVs在骨关节炎治疗中的潜力。研究发现HFP-MSC-EVs可通过多途径发挥治疗作用：抑制软骨细胞外基质降解酶表达、减轻滑膜炎症反应、促进抗炎因子释放，并可能诱导巨噬细胞向抗炎表型极化。尽管polybrene可提高EV细胞内化率，但并未增强其疗效，提示未来应更关注EV cargo的优化而非单纯追求摄取效率。值得注意的是，供体年龄显著影响EV的软骨保护能力，这为临床选择EV来源提供了重要依据。该研究为开发基于HFP-MSC-EVs的无细胞疗法奠定了实验基础，为骨关节炎治疗提供了新思路。