幽门螺杆菌VacA毒素通过TRAF1介导的4-1BB/NF-κB信号轴诱导胃上皮细胞凋亡及慢性炎症损伤的机制研究

《Molecular Medicine》：Helicobacter pylori VacA modulates TRAF1-mediated 4-1BB/NF-kappaB axis to induce host apoptosis and chronic inflammatory damage

本研究针对幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)感染导致胃癌的机制展开深入探索。研究人员发现其关键毒力因子VacA通过调控TRAF1介导的4-1BB/NF-κB信号通路，促进胃上皮细胞凋亡和炎症因子IL-8分泌，揭示了VacA-TRAF1-NF-κB-IL-8这一新型信号轴在Hp相关胃黏膜病变中的作用机制，为Hp感染相关胃癌的防治提供了新的潜在靶点。

　　

当谈到胃癌的致病因素时，幽门螺杆菌(Helicobacter pylori, Hp)感染无疑是最重要的风险因素之一。这种微需氧革兰氏阴性杆菌感染了全球超过一半的人口，被世界卫生组织列为I类致癌物。然而，并非所有Hp感染都会导致胃癌，其致病性主要取决于菌株的毒力因子。其中，空泡化细胞毒素A(Vacuolating cytotoxin A, VacA)是Hp产生的主要毒力因子之一，它能够引起宿主细胞空泡化、线粒体功能障碍，并诱导细胞凋亡。尽管已有研究表明VacA与胃黏膜病变密切相关，但其具体作用机制，特别是如何调控宿主细胞信号通路进而促进胃癌发生的过程，仍有待深入阐明。

在这项发表于《Molecular Medicine》的研究中，袁令芝等人聚焦于肿瘤坏死因子受体相关因子1(TNF receptor-associated factor 1, TRAF1)在Hp VacA诱导的胃黏膜病变中的作用。研究人员前期工作发现，在Correa级联反应的多步骤病理过程中，TRAF1表达显著增加，且这种变化与Hp毒力因子VacA密切相关。然而，其背后的分子机制尚不清楚。

为了回答这一科学问题，研究团队构建了TRAF1缺陷和过表达的人胃黏膜上皮细胞系，并利用野生型/vacA敲除突变Hp菌株、重组VacA蛋白和pDsRED2-N1-HA/VacA质粒进行机制研究。同时，他们还建立了小鼠感染模型，评估胃部病理变化。

主要技术方法包括：利用慢病毒系统建立稳定TRAF1敲低和过表达的胃黏膜上皮细胞系；通过RNA测序(RNA-seq)分析基因表达谱；采用蛋白质印迹(Western blot)检测关键蛋白表达；使用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定炎症因子水平；通过流式细胞术分析细胞凋亡；借助免疫荧光和免疫组化技术观察蛋白定位和组织表达；建立C57BL/6小鼠Hp感染模型进行体内验证。

TRAF1促进胃黏膜上皮细胞中4-1BB、NF-κB通路分子、凋亡相关蛋白及下游炎症因子的表达

研究人员首先通过慢病毒载体构建了稳定沉默或过表达TRAF1的人胃上皮细胞。转录组测序分析表明，TRAF1过表达与NF-κB通路激活和细胞凋亡呈正相关。实验结果显示，沉默TRAF1导致4-1BB表达下调、NF-κB通路分子(p-IKKα/β、p-p65)表达降低、凋亡相关蛋白(Caspase9、Caspase3和BAX)水平减少，以及下游炎症因子(IL-8、IL-6和TNF-α)分泌减少。相反，TRAF1过表达则产生相反的效果，上调了这些分子的表达。

VacA改变胃上皮细胞中TRAF1和凋亡相关蛋白的表达，上调4-1BB、磷酸化p65和IL-8

研究发现，用vacA阳性Hp菌株感染GES-1细胞、用重组VacA蛋白孵育或转染pDsRED2-N1-HA/VacA质粒，均能显著增加TRAF1、4-1BB、磷酸化p65和促凋亡蛋白Bax的表达，同时降低抗凋亡蛋白Bcl-xl的表达，并促进IL-8的释放。值得注意的是，TRAF1的表达随着细菌浓度增加或感染时间延长先升高后降低，表明存在复杂的调控机制。

VacA激活胃上皮细胞中的NF-κB信号通路

通过亚细胞分馏实验、免疫荧光分析和蛋白质印迹，研究人员证实VacA能够促进NF-κB p65的核转位。在GES-1细胞感染vacA阳性Hp菌株、用重组VacA蛋白处理或转染pDsRED2-N1-HA-VacA后，细胞核内p65水平显著增加，表明VacA确实激活了NF-κB信号通路。

VacA诱导胃上皮细胞凋亡并抑制其增殖

形态学观察显示，vacA阳性Hp菌株感染后的GES-1细胞出现细胞骨架紊乱、细胞质空泡化和细胞皱缩等凋亡特征。流式细胞术分析表明，重组VacA蛋白处理能显著增加细胞凋亡率。CCK-8实验进一步证实，VacA以时间和浓度依赖的方式抑制GES-1细胞活力。这些结果共同表明VacA具有诱导胃上皮细胞凋亡和抑制增殖的生物效应。

TRAF1过表达促进VacA诱导的4-1BB表达、NF-κB通路激活、凋亡相关分子水平及下游炎症因子分泌，而沉默TRAF1产生相反效应

基因操作实验表明，TRAF1过表达增强了VacA诱导的4-1BB表达、NF-κB通路激活、凋亡相关蛋白水平及炎症因子分泌。相反，沉默TRAF1则减弱了这些效应。特别是在GES-1细胞中干扰TRAF1表达后，VacA诱导的TRAF1、4-1BB、磷酸化p65和Bax表达显著下调，而TRAF1过表达则产生相反结果。

TRAF1过表达增强VacA诱导的NF-κB p65核转位和胃上皮细胞凋亡，而沉默TRAF1产生相反效应

细胞免疫荧光分析显示，TRAF1过表达增强了重组VacA蛋白刺激的NF-κB转录激活(表现为P65核转位增加)，而沉默TRAF1则减少了这一过程。流式细胞术分析进一步证明，TRAF1过表达放大了重组VacA蛋白对HGC27细胞的凋亡诱导作用，而抑制TRAF1表达则减弱了这一效应。

抑制NF-κB信号通路可抵消VacA对TRAF1/4-1BB/IL-8和凋亡相关蛋白表达的影响，并降低VacA的促凋亡效应

使用NF-κB抑制剂BAY11-7082处理细胞，显著减弱了vacA阳性Hp菌株感染或重组VacA蛋白对TRAF1、4-1BB、凋亡相关蛋白表达的影响，并抑制了IL-8的分泌。功能实验表明，BAY11-7082处理显著增加了GES-1细胞的增殖并降低了凋亡率，证明VacA诱导的TRAF1/4-1BB/IL-8和凋亡相关蛋白表达变化依赖于NF-κB的激活。

BAY11-7082或4-1BB阻断抗体减弱TRAF1过表达对VacA诱导的NF-κB通路激活、凋亡相关蛋白表达及下游炎症因子分泌的促进作用，而4-1BB激动抗体逆转TRAF1沉默对VacA功能的抑制作用

进一步机制研究表明，抑制NF-κB通路或使用4-1BB阻断抗体，均能减弱TRAF1过表达对VacA诱导的4-1BB、凋亡相关蛋白及下游炎症因子的促进作用。相反，使用4-1BB激动抗体可激活NF-κB通路，逆转TRAF1沉默对VacA刺激的凋亡相关蛋白的抑制作用。

VacA促进小鼠胃黏膜中TRAF1、4-1BB和NF-κB p65的表达，并加剧胃黏膜炎症损伤

体内实验显示，vacA阳性Hp菌株感染的小鼠胃黏膜中TRAF1和4-1BB表达显著增加。免疫荧光分析表明，在Hp定植部位，TRAF1、4-1BB和NF-κB P65荧光强度增强。组织学检查发现，vacA阳性Hp菌株感染12个月后的小鼠胃黏膜结构紊乱，有明显的炎症细胞浸润。

Hp根除或BAY11-7082处理可逆转VacA诱导的小鼠胃黏膜组织中TRAF1表达和炎症损伤

根除Hp治疗后，小鼠胃黏膜中TRAF1表达显著降低，且随着治疗时间延长逐渐恢复正常，与胃黏膜炎症损伤减轻相关。同样，BAY11-7082处理也逆转了重组VacA蛋白诱导的小鼠胃黏膜TRAF1表达和血清IL-8水平升高。

本研究系统揭示了Hp毒力因子VacA通过调控TRAF1介导的4-1BB/NF-κB信号轴，促进胃上皮细胞凋亡和慢性炎症损伤的新机制。研究发现不仅阐明了VacA-TRAF1-NF-κB-IL-8这一新型信号轴在Hp相关胃黏膜病变中的作用，还为理解Hp感染导致胃癌发生的分子机制提供了重要线索。特别值得注意的是，TRAF1表达在VacA刺激下呈现先升高后降低的动态变化，提示存在复杂的反馈调控机制。这一发现可能解释了在Hp感染的不同阶段，胃黏膜细胞命运决定的微妙平衡。

从临床转化角度，该研究鉴定出的TRAF1和4-1BB可能成为Hp相关胃病治疗的潜在靶点。针对这一信号通路的干预策略，或许能够为预防Hp感染相关的胃癌发生提供新思路。此外，研究结果表明Hp根除治疗或NF-κB通路抑制能够逆转VacA诱导的病理变化，这为临床治疗策略提供了实验依据。

该研究的创新之处在于首次将TRAF1与Hp VacA毒素的功能联系起来，揭示了其在胃黏膜"炎症-癌变"过程中的关键作用。这一发现不仅增进了我们对Hp致病机制的理解，也为开发针对Hp感染相关胃癌的新型防治策略奠定了理论基础。未来研究可进一步探索TRAF1在不同Hp毒力菌株感染中的作用差异，以及其在胃癌发生发展过程中的动态变化规律，为胃癌的早期诊断和精准治疗提供更多科学依据。