四种外显子组捕获平台在DNBSEQ系列高通量测序仪上的性能比较研究

《BMC Genomics》：Performance comparison of four exome capture platforms on DNBSEQ-Series high throughput sequencer

本研究针对DNBSEQ系列测序仪缺乏外显子组测序平台系统性评估的问题，研究人员通过比较四种商业外显子捕获平台在数据质量、捕获特异性、覆盖均一性和变异检测准确性等指标，建立了兼容多品牌探针的标准化杂交流程，为人类遗传学研究提供了重要的技术参考依据。

　　

在基因组学研究的快速发展中，全外显子组测序（Whole Exome Sequencing, WES）技术已成为识别基因组外显子区域致病性遗传变异的有效且经济的方法。随着测序技术的进步，DNBSEQ系列高通量测序仪因其成本效益和灵活性受到广泛关注，然而该平台上不同商业外显子捕获平台的性能尚未得到系统评估。这一技术空白使得研究人员在选择合适的实验方案时缺乏可靠参考，制约了研究效率的提升。

为了解决这一问题，李美燕团队在《BMC Genomics》上发表了针对四种商业外显子捕获平台的系统性比较研究。该研究选取了BOKE Bioscience的TargetCap Core Exome Panel v3.0、Integrated DNA Technologies的xGen Exome Hyb Panel v2、Nanodigmbio Biotechnology的EXome Core Panel以及Twist Bioscience的Twist Exome 2.0这四种平台，在DNBSEQ-T7测序仪上进行了全面性能评估。

研究人员采用标准化的实验设计，使用HapMap-CEPH NA12878标准品和PancancerLight 800 gDNA参考标准（G800）作为研究材料。通过Covaris E210超声波破碎仪将基因组DNA片段化，使用MGIEasy UDB通用文库制备套装在MGISP-960全自动样本制备系统上完成文库构建。实验设计了单重杂交（1-plex）和八重杂交（8-plex）两种模式，分别采用各厂商标准流程和MGI统一杂交流程进行外显子捕获。

关键技术方法包括：使用标准品NA12878和G800进行实验验证；通过MGISP-960系统实现自动化建库；采用单重和八重杂交设计比较捕获效率；使用MegaBOLT v2.3.0.0进行生物信息学分析；通过Picard工具评估覆盖均一性；基于GIAB标准数据集验证变异检测准确性。

Comparison of four human exome capture platforms

研究人员首先比较了四种平台的目标区域特征。虽然各平台的目标区域设计存在差异，但均能覆盖主要的编码序列区域。IDT平台在CCDS数据库的覆盖度达到99.73%，而Nad平台在NCBI RefSeq CDS的覆盖度为98.64%。四个平台在GENECODE CDS的覆盖度均达到96%以上，表明各平台均具备全面的外显子覆盖能力。

Data summary of four whole exome capture platforms sequencing

测序数据分析显示，所有平台均表现出优异的数据质量。Q30碱基比例超过95%，过滤后的reads比对率达到99.7%。Twist平台显示出最高的独特比对率（94.93%），而BOKE、Nad和IDT平台的独特比对率分别为89.16%、80.29%和78.90%。

Uniformity of coverage

覆盖均一性分析显示，在20倍测序深度下，Nad、Twist和BOKE平台均能达到98%以上的覆盖比例，IDT平台略低（96.44%）。Twist平台在30倍深度时表现出最佳的均一性，FOLD_80_BASE_PENALTY得分最低（1.31±0.06），表明其覆盖均一性最优。

Exome capture specificity

在捕获特异性方面，各平台目标区域唯一比对reads比例在65.24%到83.38%之间。八重杂交配置显示出比单重杂交更高的捕获效率，表明多重样本混合捕获策略的有效性。

GC content bias among four platforms

GC含量偏好性分析显示，所有平台在极端GC含量区域（<20%和>80%）表现相似。Twist平台在40%-60%GC含量区域显示出更均匀的覆盖分布，但在60%-80%的高GC含量区域，所有平台均出现覆盖深度下降。

Variants detection

变异检测分析表明，各平台在单核苷酸多态性（SNP）和插入缺失（INDEL）检测方面表现出高度可重复性。BOKE平台检测到最多的SNP（约29,700个），而IDT平台由于目标区域较小，检测到的变异数量较少。所有平台检测到的SNP中约99.5%可在dbSNP151数据库中找到，转换/颠换比率在2.66-2.97之间。

Variants accuracy

与GIAB标准数据集比较显示，各平台均表现出较高的变异检测准确性。SNP检测的精确度和灵敏度均超过98%，INDEL检测的精确度和灵敏度相对较低，但IDT平台在INDEL检测方面表现最佳。

Variants concordance

平台内变异一致性分析显示，SNP的Jaccard相似性达到97%以上，INDEL的一致性较低（>70%），这与INDEL检测的技术挑战性相符。IDT平台由于目标区域INDEL数量较少，显示出最高的一致性（>83%）。

Features comparison of MGI and other four commercial hybridization processes

研究人员开发的MGI统一杂交流程与各厂商标准流程相比，在变异检测一致性方面表现相当。SNP检测一致性达到97%以上，INDEL检测一致性在70%-80%之间。MGI方法将实验时间从4天缩短至1天，提高了操作效率。

Performance with detection of cancer interesting mutations

在癌症相关突变检测方面，使用BOKE平台和MGI杂交流程对G800标准品进行检测，成功识别出793个突变位点，等位基因频率在1%-100%范围内的突变均被准确检测，证明了该技术在癌症基因组学研究中的可靠性。

本研究通过系统评估四种外显子捕获平台在DNBSEQ-T7测序仪上的性能，填补了该技术平台在文献中的评估空白。研究发现各平台在数据质量、覆盖均一性和变异检测准确性方面表现相当，其中Twist平台在覆盖均一性方面表现最佳。研究建立的MGI统一杂交流程实现了多平台兼容，显著提高了实验效率。该研究为研究人员在选择外显子测序平台时提供了重要参考，推动了外显子测序技术的标准化和自动化发展。特别在癌症基因组学研究领域，该技术方案为低频突变检测提供了可靠方法，具有重要的临床应用价值。