综述：肿瘤微环境中成纤维细胞的异质性和动态相互作用——空间转录组学揭示肿瘤进展中的奥秘

《Cellular Oncology》：Fibroblasts in the tumor microenvironment: heterogeneity and dynamic interactions in tumor progression revealed by spatial transcriptomics

本综述系统阐述了空间转录组学（ST）技术如何揭示癌症相关成纤维细胞（CAFs）在肿瘤微环境（TME）中的空间异质性、功能亚型（如myCAFs、iCAFs、apCAFs等）及其与免疫细胞、肿瘤细胞的动态互作网络。文章重点探讨了CAFs通过IL-34/CSF1R、TGF-β/LOXL2、JAG1/NOTCH1等信号轴促进免疫排斥和治疗抵抗的机制，并展望了整合多组学与AI模型推动CAFs研究进入精准肿瘤学框架的前景。

　　

2 癌症相关成纤维细胞：起源及其在肿瘤进展中的作用

癌症相关成纤维细胞（CAFs）是肿瘤微环境（TME）中最丰富的基质成分，表现出显著的表型异质性。这种异质性源于多种细胞类型和转化过程，包括活化的正常成纤维细胞、上皮-间质转化（EMT）以及内皮-间质转化（EndMT）。CAFs可能起源于组织驻留细胞，或从循环中招募的骨髓来源的前体细胞并在肿瘤定植后分化。此外，周细胞、内皮细胞和上皮细胞也可以通过转分化形成CAF样表型。作为活化的成纤维细胞，CAFs是恶性实体瘤中的主要基质成分，参与TME重塑、炎症细胞活化，并在多种癌症类型中与不良预后相关。它们在胰腺癌、胆道癌、肺癌和乳腺癌等癌症的转移、免疫逃逸和治疗抵抗中发挥重要作用，使其成为有前景的治疗靶点。然而，CAFs在癌症中的作用复杂且具有情境依赖性，不同亚群可能促进或抑制肿瘤进展。

近期的单细胞和空间转录组学研究将CAFs归纳为五种功能亚型，并将离散的分子特征与不同的功能程序耦合起来。肌成纤维细胞样CAFs（myCAFs）高表达α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、血小板衍生生长因子受体β（PDGFRβ）以及细胞外基质（ECM）成分如COL1A1和骨膜蛋白（POSTN）；通过产生收缩力和沉积ECM，它们使肿瘤微环境变硬，从而在胰腺癌中促进转移并通过TGF-β信号传导导致免疫治疗抵抗，在肺癌中预示不良预后。炎症性CAFs（iCAFs）以丰富的白细胞介素-6（IL-6）、IL-11、白血病抑制因子（LIF）和CXCL12为标志，通过JAK/STAT3信号通路介导化疗抵抗和免疫抑制；在胰腺导管腺癌（PDAC）中，它们呈现CXCR4以及FGG⁺/CRP⁺的特征并取代胰岛，放大局部炎症。抗原呈递CAFs（apCAFs）是罕见的细胞，表达主要组织相容性复合体II类（MHC-II）分子（如HLA-DRA、CD74）和共刺激配体（如CD80/CD86），使其能够激活CD4⁺ T细胞；然而在胰腺肿瘤中，它们似乎扩增调节性T细胞并削弱抗肿瘤免疫。基质重塑CAFs（matCAFs）专精于ECM重塑，分泌基质金属蛋白酶11（MMP11）、基质金属蛋白酶14（MMP14）和胶原交联酶赖氨酰氧化酶样2（LOXL2）；在乳腺癌中，它们与致密的胶原纤维共定位，构建转移巢。最后，增殖性CAFs（pCAFs）以Ki-67和细胞周期基因（如CCNB1、MKI67）为特征，经历克隆扩增并驱动侵袭性疾病；在宫颈癌中，它们分泌SEMA3C和CXCL6以增强癌细胞的干性。

值得注意的是，这些亚型表现出可塑性，能够响应TME信号（例如，TGF-β驱动myCAF分化，而白细胞介素-1α（IL-1α）促进iCAF表型）而发生相互转化。空间转录组学进一步揭示了它们的空间分布偏好：myCAFs主导肿瘤核心区域，iCAFs聚集在缺氧微环境，而apCAFs则位于三级淋巴结构附近。这种精细的分类强调了CAF异质性是肿瘤进展和治疗结果的关键决定因素。

3 空间转录组学技术的进展

空间转录组学（ST）是成像、生物标志物分析、测序和生物信息学的集成，能够精确定位和量化mRNA转录本，从而实现组织切片中基因表达的精确空间图谱绘制。它还能揭示不同细胞类型的空间分布，探索细胞群体间的相互作用，并构建不同组织区域的基因表达图谱。根据检测方法，空间转录组学技术主要分为两类：基于成像的技术和基于测序的技术。

4 基于成像的空间转录组学技术

基于成像的技术，如原位杂交（ISH）和原位测序（ISS），对于在组织切片内可视化和量化mRNA转录本至关重要。ISH利用互补的单链核酸分子，通过寡核苷酸探针实现目标RNA的检测和成像，允许在显微镜下进行定量和空间定位。从最初的放射性探针标记发展到荧光原位杂交（FISH）。单分子FISH（smFISH）通过将FISH与数字成像显微镜结合，为单分子RNA分析提供了更高的灵敏度和特异性。随后出现的RNAscope技术引入了新颖的“双Z”探针设计用于信号放大和背景抑制。后续技术如循环单分子FISH（osmFISH）、顺序FISH（seqFISH）、顺序FISH+（seqFISH+）和多路错误鲁棒荧光原位杂交（MERFISH）进一步提高了检测效率。

相比之下，ISS显著提高了通量并以亚细胞分辨率捕获转录本。它使用微米或纳米尺寸的DNA珠子在测序过程中进行信号放大。著名的ISS技术包括ISS、荧光原位RNA测序（FISSEQ）、基于杂交的原位测序（HybISS）、扩展测序（ExSeq）和空间分辨转录本扩增子读出图谱（STARmap）。STARmap结合水凝胶化学、优化的挂锁探针和引物方面的进展，并引入连接测序策略，实现了小鼠皮层中数千个基因的高分辨率空间表达分析。

5 空间转录组学中的基于测序的方法

基于测序的ST平台，包括最初的基于阵列的ST方案、Slide-seq以及下一代测序（NGS）驱动的方法，如激光捕获显微切割（LCM）、原位条形码标记（ISB）和10x Genomics Visium，已经彻底改变了基因表达分析领域。基于阵列的ST方案在固定位置捕获、测序和定位组织样本中的RNA分子。在该方法中，固定在固相上的反转录引物在其原始位置释放并捕获RNA分子，生成带有位置条形码的cDNA。

Slide-seq利用DNA条形码标记的微珠实现了10μm的分辨率。NGS-based ST方法显著提高了基因检测的通量和效率。10x Genomics Visium已被广泛应用于小鼠嗅球组织等各种研究。LCM-based方法，如地理定位测序（Geo-seq）、体内转录组分析（TIVA）和邻近细胞相互作用组织学与富集细胞测序（NICHE-seq），使用激光束在显微镜下切割特定的组织区域。

ISB-based ST技术可分为两组。第一组采用固相条形码捕获（SPBC），包括10x Genomics Visium、Slide-seq、Slide-seqV2、高清晰度ST（HDST）、时空增强分辨率组学测序（Stereo-seq）、测序显微镜（Seq-Scope）、抗坏血酸过氧化物酶介导的邻近标记测序（APEX-seq）和像素化ST测序（PIXEL-seq）。第二组包括NanoString数字空间谱分析（DSP）和ZipSeq，利用选择性条形码标记。这些ST技术不仅能够分析TME内的细胞组成和分布，还有助于构建空间轨迹和相互作用网络。

6 空间转录组学中的CAFs

6.1 成纤维细胞亚群的鉴定与功能分析

空间转录组学的进展极大地增强了我们对CAFs异质性的理解，揭示了其在细胞组成、基因表达谱和空间定位上的多样性。在结直肠癌（CRC）中，ST已鉴定出三种CAF亚型：COL11A1⁺INHBA⁺ CAFs、MFAP5⁺ CAFs和FAP⁺ CAFs。Zheng等人使用10x Genomics Visium在低氧微环境中识别出COL11A1⁺ INHBA⁺ CAFs，这些细胞与维持癌症干性相关。Peng等人采用更高分辨率的Slide-seqV2，以10μm分辨率揭示了MFAP5⁺ CAFs与C1QC⁺巨噬细胞之间的紧密空间相邻性。Qi等人同样使用Visium证实了FAP⁺ CAFs与SPP1⁺巨噬细胞的共定位。

在非小细胞肺癌（NSCLC）中，Hanley等人使用10x Visium进行区域水平转录组分析，首次将CD34⁺外膜成纤维细胞与iCAF表型联系起来。Yang等人利用10x Visium绘制了早期肺腺癌（LUAD）中CAFs的空间图谱，发现THBS2⁺成纤维细胞在侵袭前沿富集。在肝细胞癌（HCC）中，Xun等人利用亚细胞分辨率的Stereo-seq精确定位了肿瘤边界处的APSN⁺ CAFs和非恶性区域的SFRP2⁺ CAFs。Wang等人整合10x Visium和单细胞转录组学，揭示了原发灶富集F3⁺ CAFs，而肝转移灶则以MCAM⁺ CAFs为主。Sun等人使用10x Visium追踪口腔鳞状细胞癌（OSCC）进展，观察到T分期依赖性的Mesen CAFs增加。

在高级别浆液性卵巢癌（HGSC）中，Ferri-Borgogno等人使用GeoMx DSP对肿瘤-基质界面进行感兴趣区域测序，发现短期存活样本中富含α-SMA⁺ VIM⁺ PDGFRβ⁺ CAFs，形成物理免疫屏障。在胰腺导管腺癌（PDAC）中，多种ST平台共同绘制了CAF的“空间图谱”：Moncada等人使用10x Visium区分了myCAFs、iCAFs和apCAFs，发现iCAFs在肿瘤外围富集，而myCAFs在核心区域富集。Ren等人进一步应用纳米级Stereo-seq揭示了FGG⁺ CRP⁺ iCAFs取代胰岛的现象。Hwang等人采用GeoMx DSP比较了新辅助化疗前后的CAF程序，显示治疗后免疫调节程序显著富集。

6.2 肿瘤微环境中成纤维细胞的空间异质性

基质细胞是TME的关键组成部分，在肿瘤生长、进展、免疫抑制和转移中扮演关键角色。ST揭示了基质细胞在TME内的空间分布偏好。在不同癌症类型中，CAFs表现出最显著的空间共定位模式。在CRC中，FAP⁺ CAFs与SPP1⁺巨噬细胞空间共定位，而MFAP5⁺ CAF来源的微纤维与C1QC⁺巨噬细胞密切相关。Zheng等人发现了COL11A1⁺ INHBA⁺ CAFs与CD44⁺ CRC细胞之间的紧密空间相互作用。在肝癌微环境中，SPP1⁺巨噬细胞和CAFs形成了一个空间定义的肿瘤免疫屏障（TIB）生态位。在皮肤癌的TME中，CAFs和巨噬细胞亚群表现出不同的空间分布模式。

CAFs还与内皮细胞和周细胞保持强烈的共定位模式。在同源重组缺陷（HRD）样本中，iCAFs与内皮细胞之间的血管生成相互作用尤为突出。在胶质母细胞瘤（GBM）中，CAFs在肿瘤干细胞（GSC）和血管周围区域富集。Davidson等人通过10x Visium发现，在透明细胞肾细胞癌（ccRCC）的间质区域，间质样肿瘤细胞和POSTN⁺ myCAFs紧密相邻。

在HGSC研究中，肿瘤细胞与邻近成纤维细胞的共定位分析显示，特定成纤维细胞亚型的缺失与良好的患者预后相关。在胰腺癌中，基质组织主要由成纤维细胞和内皮细胞组成，在PDAC微环境中观察到它们的共定位。研究发现了炎症性成纤维细胞与表达KRT19基因模块的癌细胞之间的强关联，以及应激反应基因模块与炎症性成纤维细胞特征之间的显著相关性。

CAFs在肿瘤组织中的存在与治疗反应密切相关。然而，基于ST的研究揭示了CAFs之间存在显著的空间和功能异质性。在原发性CRC肿瘤中，F3⁺ CAFs富集，而MCAM⁺ CAFs在肝转移中占主导地位。在NSCLC中，占据肺泡和外膜区域的成纤维细胞与LUAD患者的总生存期相关。在肝癌中，APSN⁺ CAFs在肿瘤边界富集，SFRP2⁺ CAFs在非恶性区域，myCAFs在非恶性点区域，它们的分布差异与患者预后显著相关。在转移性卵巢癌中，短期存活样本的基质簇中CAFs密度明显高于长期存活样本，高密度的α-SMA⁺ VIM⁺ PDGFRβ⁺ CAFs与免疫浸润减少和生存期缩短相关。在食管鳞状细胞癌（ESCC）中，iCAFs主要位于基质区域，而myCAFs在肿瘤和基质区域之间没有显示出显著的分布差异。在PDAC中，肿瘤核心的成纤维细胞表现出免疫抑制活性，而肿瘤外围的成纤维细胞则表现出免疫增强功能。

6.3 成纤维细胞与不同细胞类型的空间相互作用

在临床上，预测癌症患者对特定治疗的反应至关重要。单细胞RNA-seq揭示，特定的细胞成分可以显著影响各种癌症的治疗反应。ST进一步证明，CAF亚群的空间聚集及其与其他细胞类型的相互作用可以诱导不同的治疗结果。

目前，除了肿瘤细胞，CAFs与巨噬细胞的空间相互作用已被广泛研究。例如，在CRC背景下，MFAP5⁺ CAFs通过IL-34/CSF1R轴激活巨噬细胞的M2表型，并通过MIF/CD74信号通路促进免疫抑制环境。这些活化的髓系细胞反过来通过释放如EGF超家族蛋白和NAMPT等促肿瘤配体来调节MFAP5⁺ CAFs的活化。此外，MFAP5⁺ CAFs与促肿瘤的FAP⁺ CAFs之间的协同信号传导进一步巩固了侵袭性CRC微环境。此外，FAP⁺ CAFs通过RARRES2/CMKLR1信号促进THBS1⁺巨噬细胞向SPP1⁺巨噬细胞的转变。SPP1⁺巨噬细胞通过分泌IL1A、IL1B和TGFB1等细胞因子增强FAP⁺ CAFs中ECM相关基因的表达，从而调节结缔组织微环境。这种微环境可能阻碍淋巴细胞浸润到CRC的核心区域，降低PD-L1免疫疗法的疗效。在HCC的肿瘤边界生态位中，巨噬细胞亚群SPP1⁺ Macro与成纤维细胞亚群APSN⁺ CAFs之间的强大相互作用，以及它们与肿瘤细胞的相互作用，与ECM组织、胶原纤维组织、细胞-基质粘附、趋化性正调控和TGF-β反应等生物过程密切相关。在ESCC中，CAFs与巨噬细胞（Mps）的相互作用在肿瘤侵袭前沿尤为关键。CAFs不仅与Mops的扩增密度相关，还驱动M1向M2巨噬细胞的转化。

除了CAF-巨噬细胞相互作用，CAFs与其他免疫细胞相互作用的作用也受到关注。例如，在肝转移癌中，CAF亚群MCAM⁺ CAF通过JAG1-NOTCH1信号通路与肿瘤特异性CD8⁺_CXCL13细胞相互作用。此外，F3⁺ CAF亚群通过NRG1-ERBB3信号通路增强肿瘤侵袭性。Kang等人进一步观察到myCAFs和iCAFs在空间上呈现相互排斥的关系。HRD通过DNA损伤激活NF-κB信号通路，随后触发JAK/STAT通路，这已被证明可促进iCAF分化。相反，在非HRD背景下，增强的TGF-β信号驱动myCAF分化。Enfield等人结合Visium和scRNA-seq显示，在CRC中，α-SMA⁺ myCAFs建立了一个TGF-β驱动的ECM屏障，物理上阻止CD8⁺ T细胞进入肿瘤，限制了浸润并导致免疫逃逸；清除myCAFs或阻断LOXL2可恢复T细胞流入并使肿瘤对PD-1阻断敏感。

然而，持续的研究仍在深入探讨CAFs与肿瘤细胞之间的相互作用。例如，在转移性卵巢癌中，高度活化的CAFs与肿瘤细胞进行双向信号传导，尤其是在短期存活（STS）样本中。普遍存在的APOE-LRP5配体-受体对表明这些CAFs可能促进肿瘤生长，使肿瘤更具侵袭性、分化差且具有干细胞样特性，从而赋予化疗抵抗。此外，CAFs招募髓源性抑制细胞，损害T细胞功能并促进免疫逃逸。在NSCLC和LUAD中，肌成纤维细胞，特别是那些起源于外膜或肺泡的成纤维细胞，通过炎症和应激反应信号促进肿瘤进展。研究描绘了成纤维细胞激活的三个连续阶段：炎症细胞因子上调、应激反应信号传递以及最终纤维化胶原表达富集，导致肌成纤维细胞在肿瘤样本中积累。在LUAD的TME中，CAFs通过TGF-β1-THBS2反馈回路在肿瘤进展中发挥关键作用。在此过程中，THBS2⁺ CAFs和O-糖基化调节尤为重要，因为它们调节侵袭前沿CAFs中的CDK4-pRB轴，可能降低癌细胞的间质特性，并提供有前景的治疗策略。在宫颈鳞状细胞癌中，myCAFs通过分泌SEMA3C、POSTN和CXCL6等特定因子显著增强癌细胞干性和增殖。同时，myCAFs通过抑制淋巴细胞浸润和重塑肿瘤ECM来支持肿瘤生长和转移，从而诱导对免疫检查点阻断疗法的抵抗。在基底细胞癌中，转录重编程已被确定为肿瘤细胞侵袭性的关键驱动因素，强调了肿瘤细胞与周围成纤维细胞之间的相互影响及其通过生物对话促进肿瘤进展的作用，主要涉及上皮细胞特性和集体迁移。类似地，在口腔鳞状细胞癌和肾细胞癌中，CAFs通过TGF-β等信号通路与癌细胞相互作用，在癌症发生和进展中发挥关键作用，并最终影响患者生存。在食管癌和PDAC中，恶性上皮细胞分泌的TGF-β在塑造局部微环境表型中起核心作用，加剧ANXA1蛋白丢失，从而破坏正常成纤维细胞稳态并驱动其不受控制地向myCAFs转化，或诱导肿瘤近端成纤维细胞中比肿瘤远端成纤维细胞更高的视黄酸相关基因表达，促进肿瘤近端CAF活化并支持肿瘤生长和播散。

7 未来展望

与流式细胞术和scRNA-seq等基于解离的方法不同，空间转录组学保留了组织结构，并且当与单细胞谱交叉参考时，揭示了局限于特定肿瘤区域的CAF亚型。整合数据集的轨迹分析进一步追踪了FAP-high CAFs从肿瘤核心向侵袭边缘的路径——这种空间模式在细胞悬液中是隐藏的。目前，ST作为基于成像和测序方法的总称，在表征空间异质性和临床应用中展示了卓越的能力，使其成为研究肿瘤异质性的强大工具。该技术加深了我们对TME中成纤维细胞的理解，揭示了它们不仅在肿瘤进展和基质组成中，而且在与肿瘤细胞和免疫细胞的复杂相互作用中扮演的关键角色。全面理解成纤维细胞在TME内的功能不仅对解读肿瘤生物学至关重要，也为开发或完善精准治疗策略奠定了基础。未来的研究应侧重于阐明成纤维细胞在肿瘤进展过程中如何调节基质组成，以及它们与肿瘤和免疫细胞的相互作用，并探索如何利用这些过程来优化治疗方法。单细胞基因组学、空间转录组学和计算生物学等新兴领域的快速发展为实现精准肿瘤学的目标提供了强大工具。这些技术不仅揭示了TME内的细胞异质性和空间动态，还为药物靶点筛选、精确临床诊断和创新治疗策略的开发提供了新的见解。通过整合多组学数据和计算模型，研究人员可以更深入地了解肿瘤的分子机制，从而推进个性化治疗方案的设计和优化。