BdDHN3基因过表达增强二穗短柄草抗旱性的功能验证与生理机制研究

《Plant Physiology Reports》：Over-expression of the Brachypodium dehydrin gene, BdDHN3, enhances drought tolerance in Brachypodium distachyon (Poaceae)

本研究针对干旱胁迫对作物生产力的严重影响，开展了BdDHN3基因在二穗短柄草(Brachypodium distachyon)中抗旱功能验证的主题研究。研究人员通过比较11个遗传品系的表达谱分析，并构建35S:BdDHN3过表达株系，发现该基因在干旱条件下表达量平均提高447.2倍，过表达株系表现出更高的叶片含水量(LWC)、更低的电解质泄漏率(EL)和更高的脯氨酸含量，证实BdDHN3通过改善水分保持、减少细胞损伤和促进渗透调节来增强抗旱性，为禾本科作物抗旱育种提供了重要靶基因。

　　

干旱是影响作物生物量生产和籽粒产量的主要非生物胁迫因素。随着全球气候变化加剧，水资源短缺问题日益严重，开发抗旱作物品种成为农业可持续发展的重要课题。在植物应对干旱胁迫的复杂机制中，脱水素(dehydrin)作为晚期胚胎发生丰富蛋白(LEA)家族成员，因其在水分胁迫条件下的显著上调表达而备受关注。然而，单个脱水素基因的具体功能及其与植物抗旱性状的关联机制仍不清楚。

二穗短柄草(Brachypodium distachyon)作为温带禾本科植物的模式物种，与小麦、大麦等重要谷物作物具有密切的亲缘关系和基因同线性，是进行基因功能验证的理想材料。尽管前期研究表明脱水素同源基因在二穗短柄草中受干旱诱导表达，其中BdDHN3(Bradi1g37410)被认为是一个重要的候选基因，但该基因在二穗短柄草中的功能尚未得到实验验证。

本研究首次在二穗短柄草中对BdDHN3基因进行了系统的功能验证。研究人员首先检测了11个遗传背景不同的二穗短柄草近交系中BdDHN3基因的表达模式，评估其在不同基因型中的表达一致性。随后，在Bd21背景中构建了BdDHN3过表达(OE)株系，并从叶片含水量(LWC)、电解质泄漏(EL)、比叶面积(SLA)和脯氨酸含量等关键生理指标全面评估了转基因植物的抗旱性。

研究采用的主要技术方法包括：通过RT-qPCR分析基因表达谱；利用Gateway重组技术构建pH7WG2D-BdDHN3过表达载体；通过农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的遗传转化获得转基因株系；使用11个二穗短柄草近交系作为研究材料；通过叶片含水量测定、电解质泄漏分析、比叶面积测量和脯氨酸含量检测等生理指标评估抗旱性。

表达谱分析结果显示，干旱处理显著影响BdDHN3基因的表达(F_1,10=26.4, P<0.0001)，该基因在11个二穗短柄草品系中均受干旱胁迫上调表达，但诱导程度存在基因型差异。平均而言，干旱条件下的BdDHN3表达量是对照条件的447.2倍，其中Bd30、CASIB15、SCA5和VILLA13品系的诱导表达较强，而Bd21、CANU14和SOBRE7品系的表达相对较弱。

转基因植株的获得与验证表明，成功获得了两个独立的BdDHN3过表达株系(OE1和OE2)。在对照条件下，野生型(WT)植株中BdDHN3 mRNA水平几乎检测不到，而OE1和OE2转基因株系的表达量分别比WT高35.5倍和6.1倍，证实了转基因株系中BdDHN3的高效表达。

BdDHN3过表达增强转基因二穗短柄草抗旱性的实验结果显示，在21天的水分胁迫过程中，WT植株出现萎蔫现象，而转基因植株保持较好的水分状态和绿色外观。除SLA外，干旱对其余性状的表达均产生显著影响，且影响程度因株系而异。

具体而言，转基因植株在水分胁迫下表现出更高的叶片含水量(LWC)(比WT高7.4倍)和更低的电解质泄漏率(EL)(比WT低2.3倍)，表明其具有更好的水分保持能力和细胞膜完整性。脯氨酸的干旱诱导仅在转基因植株中显著，比WT高3.6倍，说明BdDHN3过表达促进了渗透调节物质的积累。而SLA在OE和WT植株间无显著差异，表明BdDHN3过表达主要影响生理保护机制而非叶片结构特征。

研究结论表明，BdDHN3在二穗短柄草抗旱胁迫响应中发挥重要作用。该基因的过表达通过提高水分保持能力、减少细胞膜损伤和促进脯氨酸积累来增强植物的抗旱性。不同二穗短柄草品系中BdDHN3基因的一致上调表达模式进一步证实了该基因在物种干旱响应中的关键作用。

讨论部分指出，本研究结果与现有脱水素研究文献一致，脱水素过表达通常通过改善水分保持和膜保护作用来增强抗旱性。脯氨酸含量的增加表明BdDHN3可能通过调节脯氨酸代谢来维持植物水分状态和生长。电解质泄漏率的降低提示BdDHN3可能通过抑制ROS反应和/或提高抗氧化活性来发挥保护作用，尽管本研究未直接测定抗氧化酶活性。

值得注意的是，转基因植株中SLA无显著变化表明BdDHN3主要提供短期渗透保护而非改变叶片结构特征，这种生理性状与结构性状的分离在草地植物对极端干旱的响应中已有报道。研究还发现，较干旱敏感的SCA-5品系表现出较强的BdDHN3干旱诱导表达，而较抗旱的Sobre-7和Bd21品系的诱导表达相对较低，这一现象与大麦中的研究结果不同，值得进一步探讨。

该研究的重要意义在于首次在二穗短柄草中完成了BdDHN3基因的功能验证，将基因操作与全叶片功能指标联系起来，为理解脱水素在禾本科植物抗旱机制中的作用提供了新见解。鉴于二穗短柄草与其他重要温带谷类作物的亲缘关系和基因同线性，BdDHN3基因在禾本科作物抗旱育种中具有重要应用潜力，为作物遗传改良提供了有价值的候选基因。