建立来自杜鹃花花瓣的原生质体分离、纯化及瞬时转化体系

《Protoplasma》：Establishment of protoplast isolation, purification and transient transformation system from Rhododendron petals

罗德兰属原核瞬时表达系统构建及优化。通过优化花瓣组织酶解条件（2.0%纤维素酶，1.00%甲壳素酶，0.6 mol/L甘露醇，8小时消化）和建立离心沉淀-浮选双步纯化法，结合40% PEG4000、0.10 mol/L CaCl2、35℃、25 μg质粒及20分钟孵化的转化参数，成功实现HSFC1a-eGFP和RCI2B-eGFP融合蛋白的亚细胞定位验证，qRT-PCR证实目标基因在转染12小时达表达峰值。

　　

摘要

Rhododendron属包含约1200个物种，是其所属科中最大的属，具有很高的观赏价值。然而，由于Agrobacterium介导的稳定转化系统效率低下，该属的功能基因组学研究受到限制。为了快速验证基因功能，我们利用花瓣组织开发了一种基于原生质体的瞬时表达系统。我们优化了酶解条件（2.0%纤维素酶、1.00%果胶酶、0.6 mol/L甘露醇、8小时消化时间），并建立了一种两步纯化方案，包括离心沉淀和浮选。对于聚乙二醇（PEG）介导的转化，最佳参数为40% PEG4000、0.10 mol/L CaCl₂、35°C、25 μg质粒以及20分钟的孵育时间。通过在R. pulchrum原生质体中表达HSFC1a-eGFP和RCI2B-eGFP融合蛋白，证实了该系统的亚细胞定位能力。此外，qRT-PCR分析显示HSFC1a和RCI2B的转录水平在转化后12小时达到峰值，表明其表达具有时间依赖性。