β-羟基丁酸通过MDH2 K239位点β-羟基丁酰化改善MASLD肝脂肪变性的作用与机制研究

《Cellular and Molecular Life Sciences》：β-Hydroxybutyrate enhances malate dehydrogenase 2 β-hydroxybutyrylation to alleviate hepatic steatosis in MASLD

本研究针对代谢功能障碍相关脂肪肝病（MASLD）缺乏有效靶向药物的临床困境，探讨了β-羟基丁酸（β-OHB）的治疗潜力。研究人员通过体内外实验发现，β-OHB可通过增强苹果酸脱氢酶2（MDH2）K239位点的β-羟基丁酰化（Kbhb）修饰，提升其酶活性，进而改善线粒体功能紊乱和脂质沉积。该研究揭示了β-OHB作为新型治疗分子的表观遗传调控机制，为MASLD药物研发提供了新靶点。

　　

随着全球肥胖和2型糖尿病发病率的急剧上升，代谢功能障碍相关脂肪肝病（MASLD）已成为导致不良肝脏结局的主要疾病。作为代谢综合征的肝脏表现，MASLD疾病谱涵盖从单纯性肝脂肪变性到炎症、肝硬化及肝细胞癌（HCC）等晚期肝病，同时还伴随心血管疾病和多种肝外恶性肿瘤等肝外表现。近三十年来，MASLD全球患病率已从25.3%攀升至38.2%，造成沉重的经济和临床负担。然而，除口服甲状腺激素受体-β激动剂resmetirom（Rezdiffra?）外，目前仍缺乏其他获批的靶向药物治疗方案，这凸显了优化治疗策略的迫切需求。

β-羟基丁酸（β-OHB）作为最丰富的酮体，主要在肝脏合成，参与多种生理和病理过程。除了作为替代能源外，大量研究表明β-OHB是调节代谢疾病的重要信号分子和表观遗传调控因子。研究人员发现，β-OHB可通过激活HCAR2/PKA/AMPK通路逆转衰老肝脏的代谢紊乱，而肝脏特异性缺失PPARα会降低β-OHB水平，导致肝脂肪变性和炎症。前期研究显示，2周生酮饮食（KD）能有效治疗高脂饮食（HFD）诱导的MASLD小鼠的肝脂肪变性，这主要归功于β-OHB水平的升高。尽管靶向β-OHB生产已被认为是MASLD治疗的潜在策略，但其具体作用机制尚不明确。

赖氨酸β-羟基丁酰化（Kbhb）是β-OHB介导的一种翻译后修饰（PTM），在调控基因表达和蛋白活性中发挥重要作用。异常的Kbhb模式已在多种疾病中被观察到。例如，β-OHB通过K395位点的Kbhb增加柠檬酸合酶活性，抑制脂肪酸摄取并减少心力衰竭伴射血分数保留（HFpEF）小鼠线粒体过度乙酰化。此外，KD诱导的CaMKII-α Kbhb可减少其自身磷酸化，减弱可卡因诱导的小鼠复吸行为。p53 Kbhb还能抑制p53乙酰化，导致细胞凋亡减少和细胞生长。然而，大多数关于Kbhb在代谢疾病中的研究都集中在组蛋白Kbhb上，非组蛋白Kbhb在调节代谢疾病发病机制中的作用仍待探索。

苹果酸脱氢酶2（MDH2）是三羧酸（TCA）循环中的关键酶，负责以NAD+为辅酶的可逆性苹果酸氧化。虽然MDH2功能异常与子宫内膜癌和前列腺癌等肿瘤相关，但很少有研究探讨MDH2与MASLD之间的调控关系。近期研究发现MDH2受到多种PTMs的调控。例如，葡萄糖浓度通过调节MDH2在Lys185、Lys301、Lys307和Lys314位点的乙酰化而激活其活性。此外，ZDHHC18催化的MDH2 S-棕榈酰化支持线粒体呼吸并增强卵巢癌的恶性程度。因此，合理推测MDH2也可能受到Kbhb的调控，并在MASLD治疗中发挥重要作用。

本研究旨在探讨β-OHB对MASLD小鼠的治疗效果并阐明其潜在机制。研究人员通过体内外实验证实，β-OHB能改善MASLD小鼠的脂质沉积，提高整体Kbhb水平，减轻过度活性氧（ROS）积累，增强线粒体呼吸能力，并对抗受损的脂肪酸氧化（FAO）活性。蛋白质组学分析发现，β-OHB处理的小鼠肝脏中MDH2 K239位点存在显著的Kbhb修饰，且该修饰与MDH2酶活性增加相关。研究首次揭示了β-OHB通过增强MDH2 K239位点的Kbhb修饰提升其酶活性，从而维持线粒体稳态和减轻脂质沉积的新机制。

主要技术方法

研究采用高脂饮食诱导的MASLD小鼠模型，通过腹腔注射β-OHB（300 mg/kg）进行干预。细胞实验使用AML-12和HepG2细胞系，采用油酸（OA）诱导脂质沉积模型。关键技术包括蛋白质印迹、免疫共沉淀、线粒体功能检测（Seahorse分析）、透射电镜、流式细胞术、β-羟基丁酰化蛋白质组学、代谢组学以及分子对接模拟等。

β-OHB改善MASLD小鼠肝脏脂质沉积

通过建立HFD诱导的MASLD小鼠模型，研究人员发现β-OHB给药显著降低了HFD喂养小鼠的体重和肝脏重量，而正常饮食（ND）小鼠变化不明显。血清β-OHB水平在β-OHB处理组均升高。组织学染色显示β-OHB治疗改善了HFD引起的小鼠肝细胞脂质沉积，降低了NAFLD活动度评分（NAS）。肝脏甘油三酯（TG）和总胆固醇（TC）含量减少，血清ALT、AST、TG、TC、HDL和LDL水平均下降。体外实验中，β-OHB处理也减少了OA刺激的AML-12细胞脂质积累，且呈剂量依赖性。

β-OHB调控整体蛋白质β-羟基丁酰化水平

研究发现β-OHB给药后小鼠肝脏组织和AML-12细胞中整体蛋白Kbhb水平均上升，且在HFD小鼠中上调更为明显。β-羟基丁酰化蛋白质组学分析鉴定出3,315个蛋白质和10,282个修饰位点，其中360个差异Kbhb修饰蛋白和424个差异修饰位点。GO分析显示72.22%的差异修饰蛋白富集于细胞代谢过程，亚细胞分布分析表明72个Kbhb修饰蛋白定位于线粒体。KEGG通路分析提示TCA循环相关蛋白显著富集。

β-OHB改善体内外线粒体氧化应激和功能障碍

透射电镜显示β-OHB治疗减轻了HFD小鼠肝细胞线粒体肿胀和断裂，减少线粒体附近脂滴。体外实验中，β-OHB降低了OA诱导的AML-12细胞ROS产生和线粒体ROS水平，提升了线粒体膜电位（MMP）。Seahorse分析表明β-OHB显著增强了基础、最大和备用呼吸能力。虽然临床研究报道MASLD/NASH患者FAO活性存在争议，但本研究显示β-OHB恢复了OA损伤的FAO活性，并提高了外源性棕榈酸-BSA底物的OCR。

β-OHB增强MDH2 K239β-羟基丁酰化及酶活性

蛋白质组学分析发现TCA循环相关蛋白中MDH2 K239位点Kbhb修饰显著增加。研究证实β-OHB处理提高了小鼠肝脏和AML-12、HepG2细胞中MDH2 Kbhb水平。序列同源性分析显示MDH2 K239位点在人和小鼠间高度保守。分子对接表明K239残基邻近MDH2催化中心，提示其Kbhb可能影响酶活性。酶活检测证实β-OHB增强了HFD小鼠肝脏和OA处理的AML-12细胞中MDH2活性，同时降低了底物L-苹果酸水平。

MDH2 K239 Kbhb对维持线粒体稳态和减少脂质沉积至关重要

通过构建MDH2 K239R突变体质粒，研究人员发现该突变完全消除了β-OHB诱导的MDH2 Kbhb上调和酶活性增强。MDH2^K239R过表达细胞中，β-OHB对OA诱导的ROS产生、线粒体ROS水平、OCR、MMP和FAO活性的改善作用均被削弱。同时，β-OHB对脂质沉积的改善作用在MDH2^K239R细胞中被取消，TG和TC含量显著高于野生型MDH2过表达组。这些结果证实MDH2 K239位点的特异性Kbhb修饰是β-OHB维持线粒体稳态和减轻脂质沉积的关键机制。

研究结论与意义

本研究首次揭示了β-OHB通过增强MDH2 K239位点的Kbhb修饰提升其酶活性，从而改善肝细胞脂质沉积和线粒体功能的新机制。研究发现短期β-OHB干预能在不引起显著代谢副作用的前提下，有效缓解MASLD小鼠的肝脏脂肪变性和代谢紊乱。不同于生酮饮食的局限性和安全性问题，外源性β-OHB补充提供了一种更安全、可持续的MASLD治疗替代策略。

从机制层面，研究不仅证实了Kbhb作为一种重要PTM在代谢疾病中的调控作用，还揭示了β-OHB除作为HDAC抑制剂外的表观遗传修饰功能。MDH2 K239位点的发现为理解TCA循环酶的精细调控提供了新视角，Kbhb与乙酰化（Kac）等修饰的交叉对话也为探索代谢疾病中复杂的PTM网络奠定了基础。

值得注意的是，β-OHB的生理浓度即可发挥系统效应，这与其多重角色（信号分子、表观遗传调节剂等）密切相关。最近发现的β-OHB-氨基酸（如BHB-Phe）作为内源性食欲抑制因子，也为解释β-OHB治疗的体重减轻效应提供了新机制。

尽管本研究聚焦男性MASLD模型，避免了雌激素保护的混杂效应，但性别差异对药物反应的影响仍需在未来研究中系统评估。此外，β-OHB在肾脏等肝外组织的修饰效应及其组织特异性调控机制也值得深入探索。

综上所述，该研究不仅阐明了β-OHB治疗MASLD的新机制，也为开发以MDH2 Kbhb为靶点的特异性疗法奠定了理论基础，对代谢性肝病的临床治疗具有重要指导意义。