坦桑尼亚无症状恶性疟原虫感染中PfEBA-175区域II抗原多样性的微地理变异

《Frontiers in Immunology》：Micro-geographic variation in antigenic diversity of PfEBA-175 region II in asymptomatic Plasmodium falciparum infections in Tanzania

疟疾疫苗候选分子PfEBA-175 RII的遗传多样性及抗原性分析：通过对坦桑尼亚高疟区8个村庄172例无症状感染者的测序和血清学检测，发现其RII区域具有较高核苷酸多样性（π=0.00359），且呈现正向选择（dN-dS=3.15, p<0.001），同时存在近期种群扩张（Fs=-30.614）。重组蛋白表达显示平均84.8%的血清阳性率，但存在地理差异（如Bunyambo村仅50%）。关键氨基酸突变多位于B细胞表位（如K478N）和二聚体接口（N577K），但糖基结合区保持保守。年龄与抗体反应正相关（r=0.333, p<0.001），提示累积暴露是免疫应答的关键因素。

　　### 马拉疾病：一种全球性健康挑战

尽管近年来全球范围内加强了对疟疾的防控措施，疟疾仍然是全球公共卫生领域面临的主要挑战之一。这种由疟原虫属寄生虫引起的疾病，尤其是恶性疟原虫（*Plasmodium falciparum*），依然是导致人类死亡的主要原因之一。根据世界卫生组织（WHO）发布的《2024年疟疾报告》，2023年全球范围内估计有2.63亿例疟疾病例，比2022年增加了1100万例，导致约59.7万例死亡。其中，非洲地区的负担尤为突出，贡献了全球94%的病例和95%的死亡。在非洲，坦桑尼亚是受疟疾影响最严重的国家之一，占全球病例的3.3%和疟疾相关死亡的4.4%。全球疟疾控制战略的目标已经从减少疟疾的发病率和死亡率，逐步转向彻底根除这种疾病。尽管采取了包括使用杀虫剂处理过的蚊帐、室内滞留喷洒以及有效的抗疟疾药物等策略，取得了一定的进展，但恶性疟原虫在流行地区的持续传播，导致了耐药性株的快速出现和扩散，削弱了现有的治疗手段。随着耐药性问题的加剧，针对红细胞阶段的疫苗在综合疟疾防控和消除策略中被寄予厚望，有望在未来发挥更重要的作用。

### 疟疾红细胞侵入机制与疫苗开发

疟疾的致病过程始于红细胞内的寄生虫侵入，这是血阶段疫苗研究的重点。在红细胞侵入过程中，疟原虫通过与宿主红细胞表面受体的相互作用，完成对宿主细胞的感染。研究发现，两种主要的蛋白家族——红细胞结合类似（EBL）和网状细胞结合类似（RBL）——在启动这些紧密的相互作用中起着关键作用，并被视为疫苗开发的有前景的目标。在EBL家族中，恶性疟原虫红细胞结合抗原-175（PfEBA-175）被确认为血阶段疫苗的一个重要候选抗原。抗体对PfEBA-175的反应可以阻断其与宿主红细胞受体糖蛋白A（GpA）的结合，从而防止疟原虫进入宿主细胞，从而阻断疟疾的临床发作。*pfeba-175* 基因位于第7号染色体上，由四个外显子组成，分为七个区域（RI-RVII）。其中，区域II（RII）含有两个保守的半胱氨酸富集结构域（F1和F2），在促进红细胞膜变形过程中起关键作用，这是疟原虫成功侵入宿主细胞的重要步骤。与其它区域不同，区域II直接介导了与宿主红细胞的功能性相互作用，因此成为抗侵入抗体的主要靶点。研究显示，PfEBA-175 RII能够激发强烈的抗体反应，并被自然获得免疫力个体的抗体识别。此外，PfEBA-175 RII抗体水平与保护效果之间存在一定的相关性，但这种关联在不同传播强度地区可能有所差异。

### 面临的挑战：抗原变异与疫苗开发

尽管PfEBA-175 RII显示出作为疫苗候选的潜力，但其显著的遗传多样性却给疫苗开发带来了重大挑战。这种多样性主要由免疫选择压力驱动，可能导致寄生虫逃避疫苗诱导的免疫反应，从而降低疫苗效果。因此，最近的研究强调了对PfEBA-175 RII遗传多态性的深入分析，以指导更合理的疫苗设计。另一个挑战是无症状感染的高流行率，这些感染通常被视为传播的“沉默水库”，常因常规诊断方法难以检测而被忽视。无症状感染的持续存在可能进一步促进寄生虫多样性的维持和选择，对关键抗原如PfEBA-175 RII施加持续的免疫压力。此外，评估不同流行地区中循环变异的抗原性对于确保疫苗的持续有效性至关重要。因此，解决无症状疟疾问题不仅对控制传播至关重要，而且对血阶段疫苗的成功开发和部署也具有重要意义。

### 研究背景与目标

鉴于上述挑战，本研究旨在通过直接比较坦桑尼亚高流行地区无症状个体中PfEBA-175 RII的遗传多样性与抗原性，评估其作为疫苗候选的可行性。以往的研究大多分别探讨遗传多样性或抗原性，而很少同时分析无症状感染的这两个方面。无症状携带者往往在疫苗研究中被忽视，但他们是理解传播动态和疫苗整体表现的关键群体。通过关注这一人群，本研究为PfEBA-175 RII作为高流行地区疫苗靶点的潜力提供了重要的背景信息。

### 研究方法与实施细节

本研究在坦桑尼亚的两个地区——Geita和Kigoma——开展。这两个地区在2022年报告的疟疾流行率均为13%。基于高疟疾流行率，从每个地区随机选择了两个县，Geita的Nyang’hwale和Chato，Kigoma的Kibondo和Kasulu。随后，从每个县中随机选取了两个村庄，总共纳入了八个村庄作为研究对象。研究对象包括172名无症状感染的个体，这些个体的血样在2022年12月至2023年7月间被收集。血样采集后，进行了详细的临床和免疫学分析。研究中使用的抗原蛋白来源于PfEBA-175 RII的基因序列，通过基因克隆技术表达，并用于评估抗体反应。此外，还对健康对照组进行了测试，以确认检测的特异性。所有血样均通过分子诊断方法进行了分析，包括定量PCR、基因测序和抗原性评估。研究结果表明，尽管一些样本因低寄生虫载量或较差的干血斑（DBS）质量而未能获得高质量的基因序列，但仍有122个样本成功完成了PfEBA-175 RII的测序。通过这些样本，研究团队能够分析遗传多样性，并进一步评估抗原性。

### 遗传多样性与自然选择的分析

通过对122个临床样本中*PfEBA-175 RII*基因的分析，研究发现该基因存在26个多态性位点和两个缺失突变。这些突变包括多个非同义突变，如Q584E/K（17.2%）、K279E（65.6%）和R664S（55.7%），以及一些同义突变和缺失突变。研究使用了多种中性检验方法，包括Tajima’s D、Fu和Li的D*和F*，以及Fu的Fs测试，以评估自然选择对这些多态性的影响。结果显示，虽然Tajima’s D、Fu和Li的D*和F*的值较弱且未达到统计学显著性，但Fu的Fs值显著为负（-30.614），这提供了近期种群扩张的有力证据。此外，通过计算非同义与同义替换率（d_N-d_S）的比值，研究发现该比值显著大于零（d_N-d_S = 3.15，p < 0.001），表明PfEBA-175 RII可能经历了正向选择。同时，通过McDonald-Kreitman（MK）测试，比较了物种内多态性和物种间分化，结果显示该基因在物种间经历了显著的净化选择（NI = 11.258，p = 0.003125），表明该基因在不同物种之间可能受到功能约束。然而，在物种内，该基因可能经历了不同的选择压力，这与寄生虫的免疫逃避策略有关。

### 抗体反应与抗原性分析

为了评估抗体反应，研究团队使用了重组表达的PfEBA-175 RII蛋白，并通过蛋白微阵列技术检测了无症状个体的血清样本。结果显示，无症状个体对PfEBA-175 RII的总IgG反应显著高于健康对照组，敏感性达到84.8%。然而，抗体反应在不同村庄间存在显著差异，其中Rwantaba村的抗体反应率高达95.4%，而Bunyambo村的反应率仅为50.0%。这种差异可能与不同村庄的寄生虫载量有关，尽管研究发现寄生虫载量与抗体反应之间没有显著相关性。此外，研究还发现抗体反应与年龄呈显著正相关（ρ = 0.333，p < 0.001），这表明长期暴露可能增强了抗体反应。值得注意的是，抗体反应与性别和寄生虫载量无显著相关性，说明在高传播环境中，长期暴露是塑造PfEBA-175 RII特异性免疫反应的关键因素。

### 抗原性与抗原变异的影响

研究还分析了不同氨基酸替换对抗体结合活性的影响。结果显示，某些替换显著降低了抗体结合活性，例如D168H、K448N、T198K和I275K等突变。这些突变可能改变了抗原的结构或电荷特性，从而影响了抗体的识别。相反，某些带有正电荷的氨基酸替换（如在位置226、271、279、388、390、403和577）反而增强了抗体结合，表明电荷变化在抗原识别中可能具有重要作用。值得注意的是，尽管PfEBA-175 RII在多个村庄中显示出高抗原性，但某些村庄的抗体反应较低，可能与寄生虫载量较低有关，但研究并未发现统计学上的显著差异。此外，一些关键的B细胞表位，如K478N、K481I和L482V，位于R217单克隆抗体的靶点区域，这些突变可能影响抗体的识别能力。相比之下，N577K突变位于二聚体界面，可能对自然获得的抗体反应影响较小。

### 研究发现与意义

本研究揭示了PfEBA-175 RII在坦桑尼亚高流行地区无症状感染个体中的显著遗传和抗原多样性。尽管存在高度的遗传变异，但关键的红细胞侵入相关区域仍然保持保守。这种保守性可能有助于疫苗设计，因为即使在存在抗原变异的情况下，某些区域仍可能成为有效的疫苗靶点。此外，研究发现，PfEBA-175 RII在无症状感染中仍然能够激发强烈的抗体反应，表明自然获得的免疫力在这些个体中依然存在。然而，不同地区的抗体反应存在显著差异，这提示在疫苗开发过程中需要考虑本地的免疫背景。此外，一些涉及电荷变化的氨基酸替换可能在抗原识别中起着重要作用，这些发现为疫苗设计提供了新的视角。尽管PfEBA-175 RII表现出显著的抗原性，但其遗传多样性仍可能影响疫苗的保护效果。因此，未来的研究需要进一步探索如何在抗原变异的前提下，设计能够广泛保护的疫苗。

### 未来研究方向与疫苗开发的重要性

本研究的结果为疟疾血阶段疫苗的开发提供了重要的依据。首先，PfEBA-175 RII在无症状感染个体中表现出高度的遗传多样性，这提示疫苗设计需要考虑抗原的变异情况，以确保疫苗的广泛有效性。其次，尽管存在多态性，关键的红细胞结合位点仍然保持保守，这为疫苗靶点的选择提供了支持。此外，研究发现抗体反应与年龄呈正相关，表明长期暴露是增强免疫反应的重要因素。因此，在高传播环境中，疫苗设计应考虑到个体的年龄和暴露历史。最后，研究强调了在疫苗开发过程中，结合遗传学、免疫学和流行病学数据的重要性，以确保疫苗在不同人群和地区的有效性。这些发现不仅有助于理解PfEBA-175 RII在疟疾传播中的作用，也为未来疫苗的优化和改进提供了科学依据。