通过疏水性和热响应性对类弹性蛋白多肽-融合超氧化物歧化酶进行两步纯化

《Frontiers in Bioengineering and Biotechnology》：Two-step purification of elastin-like polypeptide-fusion superoxide dismutase via hydrophobicity and thermoresponsiveness

泡沫分离与逆转变温度循环结合的两步纯化策略，高效富集并纯化重组人超氧化物歧化酶（hSODLEH），优化条件（0.4 mg/mL，30°C）下总产量85.84%，纯度达85%。

　　超氧化物歧化酶（SOD）是一种重要的抗氧化酶，其主要功能是将超氧自由基（O??）催化转化为氧气和过氧化氢，从而在细胞内保护机体免受氧化损伤。由于其在抗衰老、抗病毒和抗炎等方面的潜在应用价值，SOD在制药、化妆品和食品工业中备受关注。然而，SOD的提取和纯化仍然是一个具有挑战性的过程，尤其是在利用重组技术生产时，由于其表达水平较低以及传统纯化方法（如亲和层析和离子交换层析）存在成本高、步骤复杂以及可能导致目标蛋白活性下降等问题，使得SOD的高效纯化成为科研和工业领域亟待解决的问题。

近年来，科学家们开始探索利用融合标签（fusion tags）的特性来简化和提升SOD的纯化过程。其中，弹性蛋白样多肽（Elastin-like polypeptides, ELP）因其独特的热响应性和疏水性，被认为是替代传统纯化方法的有前景的工具。ELP通常由重复的五肽序列（VPGXG）组成，其中X可以是任何非脯氨酸的氨基酸，而n则代表重复次数，通常在20至330之间。ELP在低于其逆转变温度（Tt）时，呈现无序结构并可溶于水溶液；当温度超过Tt时，ELP会从溶液中析出并发生聚集，这一特性使其在特定条件下能够通过离心等手段进行快速分离。当ELP与目标蛋白进行基因融合后，其热响应性仍然保留，因此可以通过逆转变温度循环（Inverse Transition Cycling, ITC）来实现对重组蛋白的高效纯化。

泡沫分离（Foam Separation）作为一种新兴的分离技术，依赖于物质在气液界面的特异性吸附行为。其基本原理是表面活性物质倾向于在界面聚集，从而实现特定成分的浓缩和分离。在蛋白分离领域，泡沫分离因其低能耗、操作简便、无污染和高效率而受到广泛研究。蛋白质作为两亲性分子，具有疏水和亲水基团，因此天然具有在气液界面吸附的倾向。在泡沫分离过程中，通过引入空气形成气泡，使目标蛋白选择性地吸附在气泡表面，随后气泡上升至溶液表面形成泡沫层，可以被收集并进一步处理。该方法特别适用于从低浓度溶液中浓缩和回收蛋白质，相较于传统层析方法，具有显著的成本优势和操作简便性。

在本研究中，我们构建了一种包含ELP标签的重组蛋白hSOD-ELP（hSODLEH），并采用两步纯化策略：第一步是泡沫分离，利用ELP的疏水性使hSODLEH在气液界面特异性吸附；第二步是基于ELP热响应性的ITC纯化，通过改变温度使ELP标记的蛋白从溶液中析出，从而进一步纯化。实验结果显示，在优化条件下（初始蛋白浓度0.4 mg/mL，温度30°C），泡沫分离的蛋白浓缩倍数（Ep）为1.93，蛋白回收率（Rp）为85.67%，酶活性浓缩倍数（Ee）为2.15，酶活性回收率（Re）为93.32%。随后，通过ITC进一步纯化，蛋白回收率达到了91.98%，纯化倍数为17.45。整个两步纯化过程的总回收率为85.84%，总体纯化倍数为37.52，最终获得的hSODLEH纯度约为85%。

泡沫分离与ITC的结合，充分利用了ELP的双重特性——疏水性和热响应性，为SOD的纯化提供了一种更加高效且经济的方案。与传统层析方法相比，这种方法不仅简化了纯化流程，还降低了对昂贵层析树脂和复杂仪器的依赖，从而提升了整个纯化过程的可扩展性和实用性。此外，通过分析泡沫分离和ITC过程中hSODLEH的聚集行为和表面疏水性，我们发现ELP标签的引入显著增强了蛋白在气液界面的吸附能力，从而提高了泡沫分离的效率。同时，随着温度的升高，ELP标记的蛋白暴露更多的疏水区域，促进了其在泡沫中的进一步富集。

进一步研究显示，ELP的热响应性和疏水性对泡沫分离的性能具有显著影响。在实验中，我们通过动态光散射（DLS）和荧光显微镜分析了hSOD和hSODLEH在不同温度下的聚集行为。结果表明，当温度升高到55°C时，hSODLEH的粒径显著增加，表明其发生了自聚集现象，而hSOD则未表现出明显的聚集趋势。这一现象与ELP在高温下从无序状态转变为有序的β-转角构象有关，从而增加了其与水的疏水相互作用，使得hSODLEH更容易在泡沫中富集和分离。此外，我们还利用荧光探针ANS对hSOD和hSODLEH的表面疏水性进行了定量分析，发现hSODLEH在高温下的ANS荧光强度显著高于hSOD，进一步证实了ELP标签在提升蛋白表面疏水性方面的关键作用。

本研究还探讨了不同初始蛋白浓度对泡沫分离效率的影响。结果表明，随着初始蛋白浓度的增加，回收率（Rp）也随之提高，而浓缩倍数（Ep）则相应降低。因此，选择0.4 mg/mL作为初始蛋白浓度是优化泡沫分离过程的关键参数之一。同时，温度对泡沫分离的影响也进行了系统研究，发现当温度升高至30°C时，浓缩倍数和回收率达到最佳平衡，这表明温度在泡沫分离过程中起着至关重要的作用。

此外，我们还通过比较不同盐类对ITC纯化效果的影响，确定了（NH?）?SO?作为最适宜的纯化盐。在不同浓度的（NH?）?SO?作用下，我们观察到随着盐浓度的增加，hSODLEH的纯化倍数显著上升，而回收率则略有下降。因此，选择1.2 M（NH?）?SO?作为ITC纯化的最佳条件，能够实现较高的纯化倍数和回收率。这一结果不仅验证了ELP在热响应性纯化中的重要性，也为未来优化ELP融合蛋白的纯化条件提供了理论依据。

总体而言，本研究提出了一种基于ELP标签的两步纯化策略，通过泡沫分离和ITC相结合，实现了hSODLEH的高效纯化。该方法不仅具有较高的回收率和纯化倍数，还显著降低了纯化过程的复杂性和成本。ELP的热响应性和疏水性为蛋白质的高效分离提供了新的思路，其在工业和生物技术领域的应用潜力巨大。未来的研究可以进一步探索ELP标签的结构参数（如重复次数n和Xaa的选择）对纯化效率的影响，以优化ELP融合蛋白的性能。同时，还可以将这一方法应用于其他蛋白的纯化，开发更加广泛适用的非层析纯化技术。这种结合物理特性的纯化策略，有望为实现大规模、低成本、高效的生物制品生产提供新的技术支持。