通过多组学分析识别CAF特征基因，并构建基于CAF的肝细胞癌风险特征谱

《Frontiers in Immunology》：Identification of CAF signature genes and construction of CAF-based risk signature in hepatocellular carcinoma by multi-omics analysis

本研究利用单细胞RNA测序和空间转录组学分析，鉴定出NDUFA4L2、OLFML2B、SEMA5B和RASL12四个癌相关纤维细胞（CAFs）特征基因，并构建基于CAFs的风险模型。该模型显著预测HCC患者预后，且沉默OLFML2B能抑制CAFs诱导的HepG2细胞增殖和侵袭，提示其作为治疗靶点的潜力。

　　癌症相关成纤维细胞（CAFs）在肝细胞癌（HCC）的进展中扮演着至关重要的角色。HCC是全球第四大致命性恶性肿瘤，每年导致超过80万人死亡，主要由于其高复发率和有限的治愈手段。当前的治疗策略主要包括手术、放疗和化疗，尽管近年来在理解HCC的分子机制和探索潜在治疗靶点方面取得了显著进展，但HCC的异质性仍使得患者的预后效果不佳。因此，寻找新的治疗靶点仍然是临床迫切需要的。

HCC的肿瘤微环境（TME）是肿瘤进展的重要调节者，其中恶性细胞与基质成分之间的相互作用对肿瘤生长和治疗抵抗至关重要。CAFs主要来源于激活的肝星状细胞，是HCC微环境中最丰富的细胞类型之一。CAFs通过分泌多种细胞因子、趋化因子和生长因子，为HCC的发育和恶性进展提供了有利的内部环境。此外，CAFs还通过抑制免疫效应细胞的活性并招募免疫抑制性细胞，重塑免疫微环境，使癌细胞能够逃避免疫监视，从而影响免疫治疗的效果。因此，明确CAFs在HCC中的调控作用对于深入理解HCC进展机制以及评估患者预后和开发靶向治疗策略具有重要意义。

本研究旨在开发一种基于CAFs的风险预测模型，用于评估HCC患者的预后和免疫治疗反应，并识别潜在的治疗靶点。通过单细胞RNA测序（scRNA-seq）和空间转录组RNA（stRNA）技术，我们识别了CAFs的特征基因及其在HCC组织中的空间分布。随后，通过免疫组织化学（IHC）验证了候选蛋白的表达。基于这四个特征基因构建的CAFs风险模型展示了其在HCC患者预后预测中的价值。此外，功能实验进一步揭示了OLFML2B在CAFs介导的HCC进展中的关键作用，表明其可能作为潜在的治疗靶点。

为了深入研究CAFs在HCC中的作用，我们利用scRNA-seq数据集GSE242889进行分析。首先，我们检查了每个细胞的特征、计数、线粒体（MT）和血红蛋白（HB）水平。经过过滤，我们得到了9029个适合进一步分析的细胞。通过无监督聚类分析，我们识别了28个不同的细胞簇，并进一步将其标注为13种细胞亚型，包括巨噬细胞、三种树突状细胞亚型、癌细胞、内皮细胞、单核细胞、B细胞、T细胞、CAFs、库普弗细胞、NK细胞和肥大细胞。分析结果显示，CAFs约占总细胞数量的10%。通过评估亚型内的转录同质性和标志基因定位，我们确认了细胞亚型标注的准确性。此外，我们分析了特定标志基因的分布，进一步验证了细胞类型注释的可靠性。

为了识别CAFs特征基因，我们利用DESeq2、edgeR和limma包筛选了正常组织与HCC组织之间的差异表达基因（DEGs）。结果显示，768个重叠的DEGs被鉴定为潜在的CAFs特征基因。进一步的生存分析表明，这四个特征基因（NDUFA4L2、OLFML2B、SEMA5B和RASL12）与HCC患者的生存率呈负相关。通过IHC染色验证，这四个基因在HCC组织中的表达显著高于正常组织，进一步支持了它们在HCC进展中的作用。这些发现表明，这四个CAFs特征基因在HCC的进展中发挥了重要作用。

基于这四个特征基因构建的CAFs风险模型在HCC患者中展示了显著的预后预测价值。我们利用TCGA队列对HCC患者进行了风险分组，并通过Kaplan-Meier（KM）生存分析发现，低风险组患者的生存时间更长，生存概率更高。多变量Cox回归分析进一步确认了风险评分作为独立预后预测因子的重要性。为了增强模型的临床适用性，我们构建了一个结合风险评分和临床病理特征的列线图，用于预测HCC患者的1年、3年和5年总体生存率。校准曲线分析表明，该模型的预测结果与实际观察结果高度一致，显示出良好的预测性能。此外，基因表达分析显示，高风险组中RAP2A、NDUFA4L2、OLFML2B和SEMA5B的表达显著升高，而低风险组中CASQ2、FMO3和MYH11的表达则显著增加。这些结果强调了CAFs风险模型在HCC患者预后分层中的临床意义。

为了进一步探索CAFs风险模型的分子机制，我们对低风险组和高风险组之间的差异表达基因（DEGs）进行了GO和KEGG通路富集分析。结果显示，高风险组中上调的基因主要参与炎症、缺氧和纤维化过程，包括髓样白细胞组织、巨噬细胞激活、细胞外基质（ECM）组织和对缺氧的反应。下调的基因则主要与免疫球蛋白生产和免疫介质合成相关。KEGG通路富集分析表明，高风险组中cAMP信号通路、钙信号通路和Wnt信号通路显著上调，而黏蛋白型O-糖基化合成和Hedgehog信号通路显著下调。这些结果表明，CAFs风险模型所涉及的通路在HCC进展中具有重要的机制联系，从而增强了模型的生物学相关性。

CAFs与HCC微环境中的免疫细胞密切互动，刺激其促肿瘤活性。已有研究表明，CAFs通过赋予树突状细胞耐受性特征、促进T细胞无能和诱导调节性T细胞（Tregs）分化，从而促进HCC的免疫耐受。在本研究中，高风险组表现出更高的免疫细胞浸润水平和更显著的免疫抑制性Tregs浸润，这与Dong等人的研究结果一致。这些发现可能对个性化免疫治疗策略的开发具有重要意义。

OLFML2B是一种包含嗅觉受体样结构域的细胞外基质蛋白，其在细胞间粘附和肿瘤发生中的作用至关重要。已有研究表明，OLFML2B在多种癌症中高表达，并与不良预后、肿瘤分期、TME重塑和免疫细胞浸润密切相关。近年来，OLFML2B在HCC进展中的作用也受到关注，其在肝硬化阶段预测HCC发生具有潜在价值。此外，最新的研究发现OLFML2B在衰老的CAFs中高表达，并被鉴定为与衰老CAFs相关的关键预后基因。基于OLFML2B和九个其他基因构建的CAFs衰老评分模型能够准确预测HCC患者的预后。尽管已有研究证实OLFML2B与HCC的恶性进展有关，但其具体的致癌机制仍不清楚。在本研究中，我们通过功能实验发现，敲低CAFs中的OLFML2B显著抑制了其对HepG2细胞增殖和侵袭的促进作用，表明OLFML2B可能是HCC治疗中的潜在靶点。

综上所述，我们利用开放的scRNA-seq和stRNA数据，鉴定了四个与HCC显著负相关的CAFs特征基因（NDUFA4L2、OLFML2B、SEMA5B和RASL12）。基于这些基因构建的CAFs风险模型能够预测HCC患者的生存情况，并反映TME的免疫景观。此外，功能验证表明OLFML2B是CAFs介导的HCC进展的关键调节因子。我们的研究为理解CAFs驱动的HCC机制提供了新的视角，并为开发针对HCC的靶向治疗策略提供了潜在的分子靶点。这些发现不仅加深了我们对HCC进展机制的理解，也为改善患者的预后和治疗效果提供了新的思路。