对70名患有严重青少年特发性脊柱侧弯的受试者进行全面基因筛查，发现了新的致病变异以及与相关综合征的关联

《Frontiers in Medicine》：Comprehensive genetic screening of 70 severe adolescent idiopathic scoliosis probands reveals novel pathogenic variants and syndromic associations

特发性脊柱侧弯（IS）的严重病例遗传机制研究显示，通过全外显子测序（WES）和SNP芯片分析，在70例患者中发现致病性拷贝数变异（CNVs）、Runs of Homozygosity（ROHs）及罕见SNVs，包括8号染色体43.6 Mb重复、X染色体三体及DMD基因缺失。研究证实IS存在显著遗传异质性，13%病例携带可致病变异，建议将基因检测整合至严重IS诊断流程以指导个性化治疗。

　　研究团队对脊柱侧凸（scoliosis）这一复杂的骨骼发育异常进行了深入的分子机制分析，特别是针对严重型的脊柱侧凸（Severe Idiopathic Scoliosis, IS）。脊柱侧凸是一种三维脊柱畸形，通常通过X光成像中的Cobb角测量法来诊断，当弯曲角度达到10度以上时即可确认为脊柱侧凸。根据现有研究，大约80%的脊柱侧凸病例属于特发性脊柱侧凸（Idiopathic Scoliosis, IS），即其病因尚不明确。这种疾病在青少年群体中尤为常见，其中女孩患病比例是男孩的10倍以上，且病情往往更为严重，进展也更快。尽管存在性别差异，但并未发现明确的性连锁遗传模式，这一现象被称为Carter效应，表明男性可能需要携带更高的遗传负担才能发展为该疾病。

IS的患病率因地区而异，通常影响约2–3%的人群。尽管研究显示IS可能具有一定的遗传成分，但其确切的遗传基础仍然难以确定，主要原因是疾病的异质性。目前的研究表明，IS的遗传模式可能是多基因的，但具体的基因位点和机制仍不明确。为了更全面地理解IS的遗传基础，研究团队选择了具有统一民族背景的严重脊柱侧凸患者群体，这些患者需要接受手术治疗，其脊柱弯曲角度中位数为59度。由于只有极少数IS患者（0.1–0.3%）的弯曲角度超过40度，研究团队假设这一严重患者群体相较于一般IS患者（AIS）群体中，携带更多的构成性（constitutional）或后生（post-zygotic）的致病性变异。

本研究采用了一种综合的分子分析方法，同时评估构成性变异和后生变异。为了实现这一目标，研究团队从患者的关节突（articular processes）和血液样本中提取DNA，进行全外显子组测序（WES）和SNP芯片分析，以检测构成性拷贝数变异（CNVs）、拷贝数改变（CNAs）以及同源区域（ROH）。这种策略使得研究团队能够探索那些尚未在IS研究中被充分分析的遗传机制。研究的主要目的是识别严重AIS患者中的构成性及后生变异，从而为未来的研究和个性化遗传咨询及临床管理提供依据。

研究团队采用了一套严格的伦理标准，所有参与研究的个体均获得了书面知情同意，且研究过程符合《赫尔辛基宣言》的相关规定。此外，研究团队还收集了两个对照组的数据，以确保结果的可比性。对照组包括来自同一民族背景的女性乳腺癌患者，其样本数量分别为440个皮肤样本和142个血液样本。这些对照组未根据脊柱侧凸状况进行筛选，其患病率估计为3%。通过这些对照数据，研究团队能够更准确地评估IS患者的遗传特征。

在DNA提取过程中，研究团队采用了两种不同的方法：对于血液样本，使用QIAamp DNA Blood Midi Kit进行提取；而对于固体组织样本，则采用传统的酚-氯仿法。DNA的质量和数量通过分光光度计和荧光计进行检测，以确保后续分析的准确性。SNP芯片分析使用Illumina Infinium Global Screening Array Multiple Disease（GSA-MD-24v3-0-EA_20034606_A1）进行，数据经过Nexus Copy Number软件和MoChA管道进行分析，以识别CNVs和ROH。同时，BCFtools/RoH命令用于检测ROH，通过隐马尔可夫模型和1000 Genomes数据库的等位基因频率作为参考，排除了质量评分低于90（fwd-bwd phred）或长度小于5 Mbp的变异。

WES数据的分析则采用了基于GATK4的最佳实践流程，将数据与参考基因组（hg38）比对。对于构成性变异，研究团队使用Platypus v0.8.1.1进行检测，该工具在WES数据中表现出优越的构成性变异检测能力。而对于后生变异，研究团队使用Octopus v0.7.4进行分析，该工具采用了一种基于单倍型的算法，特别优化用于检测低频变异，包括镶嵌变异。所有变异需要满足一定的筛选标准，如映射质量≥30、支持高质量碱基（≥30）且读数数量≥5，且位于目标区域。此外，变异的功能注释使用ANNOVAR工具完成，而过滤过程则通过R v4.1.2进行。

在变异筛选过程中，研究团队首先应用了筛选标准，以评估那些与IS相关联的基因中的变异。研究团队共识别了45个变异，分布在38个个体中，其中17个为截断性变异，出现在30%（21/70）的个体中；28个为非截断性变异，出现在34.3%（24/70）的病例中。这些变异中，12个为不同的致病性或可能致病性变异，出现在16个个体中，包括14个基因中的17个截断性变异和3个非截断性变异。这些变异被归类为致病性或可能致病性，依据当前的诊断标准。其中，7个为无义变异，出现在DHCR7、FANCM、FLNB、NEB、OBSL1、RPGRIP1L和WDR81基因中；3个为移码变异，出现在FANCL、NALCN和TMEM67基因中；2个为错义变异，出现在LMNA和SLC26A2基因中；2个为剪接变异，出现在TMEM231和UPB1基因中。所有这些变异在gnomAD数据库中均未被报道，或其频率极低（“popmax” < 0.005），表明这些变异可能是导致严重IS的关键因素。

此外，研究团队还分析了那些未被先前研究发现与IS相关联的基因中的变异。这些变异中，有97个为致病性或可能致病性，554个为变异意义未明（VUS），702个为良性或可能良性。非截断性变异中，有62个为致病性或可能致病性，355个为VUS，99个为良性或可能良性。这些变异分布在151个基因中，其中20个基因中出现了26个异质性变异，这些变异在31个无亲缘关系的个体中被观察到。这些发现表明，某些基因的异质性变异可能与严重IS有关，但其具体机制仍需进一步研究。

在构成性变异的分析中，研究团队发现了一些可能与IS相关的基因，如FLNB和LMNA。这些基因的变异已被证实与一些常染色体显性（AD）疾病有关，如Larsen综合征、Laminopathies、家族性部分脂肪营养不良以及先天性肢体和面部挛缩、肌张力低下和发育迟缓。这些疾病通常表现出脊柱侧凸或其他骨骼异常。研究团队还发现了一些与常染色体隐性（AR）疾病相关的致病性变异，如ENAM和FLNB。尽管这些变异在一般人群中通常不表现出症状，但在某些罕见情况下，可能会导致症状的出现或增加疾病易感性。

在比较IS患者与对照组中异质性致病性变异的频率时，研究团队发现IS患者中的异质性致病性变异频率为22.86%（16/70），而对照组中为14.08%（20/142）。这一差异在统计学上并不显著（Fisher精确检验，p值=0.12），因此需要谨慎解释。此外，研究团队还发现了一些与ENAM基因相关的罕见致病性移码变异，这些变异在四名无亲缘关系的个体中被观察到，且在统计学上具有显著性（p=0.04）。然而，由于研究团队的问卷并未专门询问牙齿状况，且参与者未自发报告任何牙齿异常，因此无法确定这些个体是否具有与ENAM相关的牙釉质发育不良（AI）特征。此外，这些个体均未报告有家族性脊柱侧凸病史，进一步限制了ENAM关联的解释。尽管没有直接证据表明ENAM与脊柱侧凸有关，但某些研究暗示牙齿问题和脊柱畸形可能同时存在。Fuchs等人发现，ENAM的变异会影响突变小鼠模型中的骨骼和能量代谢，这表明ENAM可能具有多效性，但这一发现仍需在具有全面牙齿表型的队列中进行验证。

研究团队还特别关注了后生变异在严重IS中的潜在作用。为了探索这一可能性，研究团队首次系统地分析了IS患者中后生变异，使用了配对的血液和手术中获取的脊柱组织样本。通过SNP芯片和WES分析，研究团队未发现任何组织特异性镶嵌变异，这表明后生变异在严重IS中的作用可能不显著。研究团队的平均测序覆盖度为157倍，可能无法检测到低于10%变异等位基因频率的低水平镶嵌变异，因此仍有可能存在罕见或组织受限的事件。这些发现对于未来的病因研究具有重要意义，表明构成性变异可能比后生变异在严重IS的发病机制中起更大作用。

尽管研究团队采用了严格的筛选流程和多基因分析方法，但研究仍存在一些局限性。首先，对照组未完全标准化，仅包括女性样本，且未进行脊柱侧凸筛查，这可能影响研究结果的可比性和普遍适用性。其次，家族病史是通过自我报告收集的，而未对家族成员进行临床检查，这可能影响临床解释的准确性。这些因素在将研究结果推广到更广泛的人群时需要考虑。

研究团队的发现表明，遗传分析在严重IS患者中具有潜在的临床价值。由于严重脊柱侧凸（Cobb角>40°）通常暗示着较强的遗传基础，因此分子分析可能有助于制定个性化的治疗方案，并为遗传咨询提供重要信息。此外，研究团队的发现强调了将遗传检测纳入严重IS患者的诊断流程的重要性，以提高疾病的诊断准确性和管理效率。尽管目前尚无针对IS的常规遗传检测推荐，但研究结果表明，对于严重IS患者，进行分子分析可能具有显著的临床意义。

未来的研究应考虑采用更深入的测序技术或单细胞方法，以探索可能被当前检测方法遗漏的罕见镶嵌变异。此外，研究团队建议在诊断流程中首先使用SNP芯片分析作为成本效益高的筛查工具，因为大型结构变异可能在IS的遗传病因中占较大比例。如果SNP芯片分析结果为阴性，则可进一步使用WES进行更全面的分析，因为WES不受预定义基因组的限制，而文献表明这些基因组通常不具有重复性。这种方法在具有多基因变异的多样化人群中可能更具适用性，因为针对特定人群的基因组检测可能无法可靠地捕获所有致病性变异。早期识别遗传因素可能有助于制定更有效的治疗策略，并为遗传咨询提供重要信息。