受损的NLRP3炎性体信号通路会改变巨噬细胞中焦亡途径与凋亡途径中caspase的激活顺序

《Frontiers in Immunology》：Impaired NLRP3 inflammasome signaling diverts pyroptotic to apoptotic caspase activation in macrophages

NLRP3炎症小体在信号延迟或caspase-1缺乏时可招募caspase-8/9/3，通过GSDME介导的坏死途径调控细胞死亡，VX-765作为caspase-1抑制剂可抑制多种caspase活性。

　　NLRP3（NOD-like receptor family pyrin domain-containing 3）炎性小体是先天免疫系统中重要的防御机制之一，它在识别危险信号后，通过依赖caspase-1的细胞焦亡（pyroptosis）和细胞因子释放，参与宿主对病原体入侵或组织损伤的反应。这一机制在维持免疫稳态和清除病原体方面发挥着关键作用。然而，当NLRP3信号通路受损时，宿主是否能够通过其他形式的细胞死亡机制来应对危险信号，仍然是一个未完全解答的问题。本研究通过构建两种模拟NLRP3信号受损的巨噬细胞模型，即延迟触发信号和caspase-1缺陷模型，探索了NLRP3/ASC平台在不同情况下对细胞死亡途径的调控作用。研究发现，当NLRP3被及时激活时，其主要招募的是caspase-1，从而引发细胞焦亡；然而，在延迟触发信号的情况下，NLRP3/ASC平台则倾向于招募caspase-8，进而导致凋亡相关caspase的激活。此外，在caspase-1缺陷的巨噬细胞中，nigericin（一种NLRP3激活剂）不仅能够激活caspase-8，还能激活caspase-9和caspase-3，最终通过GSDME介导的二次坏死（secondary necrosis）完成细胞死亡。这一发现表明，NLRP3炎性小体在常规信号通路受损时，具有切换至其他细胞死亡形式的能力，这可能是一种宿主对抗病原体的适应性机制。

### 炎性小体的结构与功能

NLRP3炎性小体的核心组成包括NLRP3蛋白、凋亡相关斑点样蛋白（ASC）以及caspase-1。这些成分通过特定的结构域相互作用形成复合体，从而启动炎性小体的激活过程。在正常情况下，NLRP3的表达受到病原体相关分子模式（PAMPs）或损伤相关分子模式（DAMPs）的调控，如脂多糖（LPS）可诱导NLRP3和pro-IL-1β的表达。而ASC和caspase-1的表达则相对稳定，无需额外的危险信号即可存在。ASC通过其PYD结构域与NLRP3结合，同时通过CARD结构域与caspase-1相互作用，形成炎性小体平台。这一平台促使caspase-1发生自切割，进而激活其功能，处理pro-IL-1β和pro-IL-18，使其转化为成熟的细胞因子，并切割gasdermin D（GSDMD），释放其N端片段（GSDMD-NT），该片段在细胞膜上形成孔洞，促进细胞因子的释放和细胞膜破裂，最终导致细胞焦亡。细胞焦亡不仅释放炎症因子，还能诱导免疫反应，有助于清除病原体，同时对宿主组织造成损伤，从而在感染或炎症过程中起到双重作用。

### 病原体对炎性小体的干扰

尽管宿主演化出复杂的炎性小体系统来应对病原体感染，但一些病原体已经发展出规避这一防御机制的策略。例如，寨卡病毒的非结构蛋白NS3能够干扰NLRP3炎性小体的激活，通过破坏ASC的寡聚化，阻止其与NLRP3和caspase-1的结合。此外，一些病毒如SARS-CoV-2编码的caspase-1抑制蛋白NSP1和NSP13，或通过编码蛋白酶（如Enterovirus 71）直接切割caspase-1，从而抑制其激活。在某些感染过程中，如沙门氏菌感染，caspase-1和caspase-8可以独立激活，其中caspase-8的激活依赖于NLRC4和ASC。值得注意的是，当caspase-1缺失时，NLRC4激活剂或其他危险信号可能诱导ASC与caspase-8的相互作用，从而引发凋亡。然而，目前尚不清楚在NLRP3信号受损的情况下，caspase-1是否能够引导caspase-8的激活。

### 慢性炎症与免疫耐受

与急性感染不同，慢性感染可能引发免疫耐受，使得免疫细胞对危险信号变得不敏感。例如，克罗恩病患者的经典单核细胞表现出“耗竭”状态，其对LPS的反应减弱，导致IL-1β释放减少，这与慢性炎症性疾病的发生密切相关。长期暴露于内毒素（如LPS）可以改变巨噬细胞的代谢模式，如呼吸作用和分泌物的变化，使其进入一种低反应性的“记忆”状态。这种状态不仅影响局部免疫反应，还可能对全身免疫系统产生深远影响，导致诸如动脉粥样硬化、糖尿病和帕金森病等慢性疾病的出现。此外，反复的LPS刺激会诱导肺部选择性免疫抑制，降低对细菌性肺炎的易感性，但不会影响中性粒细胞的反应。然而，NLRP3激活剂是否能在LPS耐受的巨噬细胞中触发caspase-1或caspase-8的激活，仍需进一步研究。

### 研究方法与实验设计

本研究采用两种巨噬细胞模型来模拟NLRP3信号通路的损伤：延迟触发信号模型和caspase-1缺陷模型。在延迟触发模型中，BMDMs（小鼠骨髓来源的巨噬细胞）首先被LPS（500 ng/mL）刺激4小时，随后在12小时的“静息”阶段后，再用相同剂量的LPS或nigericin进行二次刺激。在caspase-1缺陷模型中，使用caspase-1缺失的细胞系，观察NLRP3激活剂对细胞死亡通路的影响。此外，研究还使用了人源THP-1细胞（经PMA分化为巨噬细胞）和RAW 264.7细胞（缺乏ASC表达）作为实验对象，以进一步验证不同细胞类型对NLRP3激活剂的反应差异。

为了检测细胞死亡类型，研究采用了多种方法，包括PI（碘化丙啶）掺入实验、LDH（乳酸脱氢酶）释放实验、Annexin V-EGFP凋亡检测以及Western blot分析。PI掺入实验用于评估细胞膜完整性，而LDH释放则反映细胞内容物的泄漏情况。Annexin V-EGFP检测可以区分早期凋亡（Annexin V+PI-）和晚期凋亡或坏死（Annexin V+PI+）的细胞。Western blot则用于检测不同caspase的激活状态，如caspase-1、caspase-8、caspase-9和caspase-3，以及GSDMD和GSDME的剪切情况。此外，研究还利用免疫荧光显微镜观察NLRP3、ASC和caspase的亚细胞定位，以确认其在细胞内的共定位情况。为了检测细胞内活性氧（ROS）水平和线粒体膜电位（MMP）变化，研究采用了DCFH-DA染色和JC-1染色等方法，进一步揭示NLRP3激活剂对线粒体的潜在影响。

### 实验结果与分析

研究发现，在LPS预处理后及时给予nigericin刺激的野生型（WT）巨噬细胞中，NLRP3/ASC平台主要招募caspase-1，从而引发细胞焦亡。然而，当nigericin刺激被延迟至12小时后，NLRP3/ASC平台则倾向于招募caspase-8，导致凋亡相关caspase的激活。这一现象表明，NLRP3炎性小体具有一定的灵活性，能够在常规信号通路受损时，切换至其他细胞死亡机制。此外，在caspase-1缺陷的巨噬细胞中，nigericin不仅激活了caspase-8，还激活了caspase-9和caspase-3，最终通过GSDME的剪切引发二次坏死。这进一步支持了NLRP3/ASC平台在caspase-1缺失的情况下，能够作为凋亡相关caspase的激活平台。

令人意外的是，caspase-1抑制剂VX-765不仅抑制了caspase-1的激活，还表现出对caspase-8、caspase-9和caspase-3的广谱抑制作用。这一现象表明，VX-765可能不仅仅是一个caspase-1特异性抑制剂，而是一个具有广谱抑制活性的化合物。此外，研究还发现，NLRP3激活剂在WT和caspase-1缺陷的巨噬细胞中均能诱导线粒体损伤，表现为ROS的增加和线粒体膜电位的丧失。这一发现提示线粒体损伤可能是NLRP3激活通路中的一个上游事件，可能在细胞死亡过程中起到关键作用。

### 讨论与意义

本研究揭示了NLRP3炎性小体在不同条件下的动态行为，特别是在常规信号通路受损时，其能够通过招募不同的caspase，如caspase-1或caspase-8，来调整细胞死亡的类型。这种机制可能为宿主提供了一种应对病原体感染的适应性策略，即在caspase-1无法正常发挥作用时，通过其他凋亡相关caspase的激活来维持免疫反应。然而，这种切换机制的具体分子基础仍需进一步研究。例如，ASC是否通过其PYD结构域与caspase-8结合，或者是否通过其他方式协调不同caspase的激活，仍是一个开放性问题。

此外，研究还发现，NLRP3激活剂在caspase-1缺陷的巨噬细胞中诱导的GSDME剪切可能与caspase-8的激活有关，但具体的机制仍需深入探讨。VX-765的广谱抑制作用可能与其对线粒体的干预有关，例如，它可能将caspase-1的p10片段滞留在线粒体中，从而影响其在细胞质中的活性。这种现象提示，在某些情况下，caspase-1的活性可能不能仅通过其p10或p20片段的水平来准确评估，而需要结合其他指标进行综合分析。

从更广泛的视角来看，NLRP3炎性小体的这种适应性行为可能对理解慢性炎症的发生机制具有重要意义。例如，当宿主长期暴露于低剂量的LPS时，可能通过诱导免疫耐受，减少对危险信号的反应，从而避免过度的炎症反应。然而，这种耐受状态可能导致NLRP3炎性小体的激活能力下降，进而影响宿主对病原体的清除能力，增加慢性疾病的风险。因此，如何克服NLRP3炎性小体的激活无能，以及如何避免延迟触发信号导致的慢性炎症，是未来研究的重要方向。

### 结论

本研究揭示了NLRP3/ASC平台在不同刺激条件下的动态调控能力。在常规的NLRP3激活情况下，caspase-1是主要的执行者，驱动细胞焦亡和细胞因子释放。然而，当NLRP3激活被延迟或caspase-1缺失时，NLRP3/ASC平台则倾向于招募凋亡相关caspase，如caspase-8、caspase-9和caspase-3，从而诱导凋亡或二次坏死。这种细胞死亡途径的切换可能是一种宿主应对病原体感染的适应性策略，有助于在常规防御机制失效时，仍能维持一定的免疫反应。同时，VX-765的广谱抑制作用表明，其可能在多种细胞死亡通路中发挥作用，为治疗与NLRP3相关炎症性疾病提供了新的思路。未来的研究需要进一步探讨NLRP3炎性小体如何在不同条件下协调多种caspase的激活，并揭示其在慢性炎症中的潜在作用。