次氯酸盐激活的替代分析物荧光探针，用于急性肾损伤的微量级快速检测

《Analyst》：Hypochlorite-activated analyte-replacement fluorogenic probes for minute-level fast detection of acute kidney injury

本研究开发了一种高灵敏度近红外荧光探针Cy-PITC，可在尿液样本中快速（<2分钟）检测微量次氯酸（HClO），有效区分健康与急性肾损伤（AKI）患者，灵敏度和特异性显著优于传统血清肌酐检测，适用于资源有限场景的便携式AKI诊断。

　　急性肾损伤（AKI）是一种严重的临床病症，其高发病率、高死亡率以及对医疗资源的巨大消耗，使其成为全球公共卫生领域关注的重点。目前，AKI的诊断主要依赖于血清肌酐水平和尿量的变化，这些指标虽被KDIGO指南广泛认可，但往往滞后于实际肾损伤的发生，通常在24至48小时后才能被检测到。因此，早期、快速且非侵入性的AKI检测方法对于改善患者预后、降低致残率和死亡率具有重要意义。

近年来，随着生物传感技术的发展，荧光探针因其高灵敏度、快速响应和操作简便的优势，逐渐成为疾病监测的重要工具。已有研究开发了多种用于AKI检测和成像的荧光探针，但大多数探针需要通过静脉注射后进行体内成像，这不仅限制了其在临床中的应用，还面临严格的伦理审查和药物临床试验的挑战。相比之下，基于尿液的荧光诊断方法因其非侵入性、样本易获取以及操作简便，展现出更广阔的应用前景。

本研究开发了一种近红外（NIR）荧光探针Cy-PITC，用于快速、选择性地检测尿液中的痕量次氯酸（HClO）或次氯酸盐（ClO?）。HClO作为一种潜在的AKI生物标志物，具有时空受限的生成特性以及可定量的尿液排泄模式。在AKI发生初期，肾近端小管中的髓过氧化物酶（MPO）会被激活，导致HClO的短暂爆发，这一现象与系统性炎症（如类风湿性关节炎和败血症）中持续低水平的HClO生成形成鲜明对比。此外，HClO的分子量较小（56 Da），易于通过肾小球滤过进入尿液，从而避免了较大分子标志物常见的蛋白结合干扰。

Cy-PITC的设计基于一个七甲基氰基（heptamethine cyanine）荧光骨架，通过哌嗪连接子与苯基异硫氰酸酯（PITC）偶联。当HClO与探针中的硫脲基团发生氧化反应，生成尿素后，会恢复七甲基氰基的共轭π系统，从而激活近红外荧光（798 nm）。这一设计不仅显著降低了生物基质中的背景自荧光干扰，还实现了亚秒级的反应速度，使得对HClO短暂波动的实时监测成为可能。与现有探针相比，Cy-PITC的反应时间从1至20分钟缩短至1秒内，灵敏度也大幅提升，其检测限为0.517 μM，且在50%稀释的人尿缓冲液中表现出对其他活性氧（ROS）的优异选择性。

为了验证Cy-PITC在复杂生物基质中的诊断可靠性，我们进行了系统评估。结果显示，Cy-PITC在50%稀释的人尿缓冲液中对ClO?的选择性显著优于其他ROS干扰物。此外，Cy-PITC在不同生理尿液pH值（4.6–8.0）范围内均表现出良好的稳定性，其活性保留率达到50%以上。这些特性使Cy-PITC在临床应用中具备较高的可行性，尤其适用于资源有限的环境，如家庭、农村诊所和冲突地区。

为了进一步评估Cy-PITC在细胞成像中的应用潜力，我们使用人肾细胞（HK-2细胞）进行实验。结果显示，Cy-PITC在24小时的细胞暴露后未表现出显著的细胞毒性，证实了其良好的生物安全性。同时，Cy-PITC能够有效报告与AKI相关的氧化应激情况。在使用顺铂（cisplatin）处理的AKI模型细胞以及外源性ClO?刺激的细胞中，均观察到强烈的细胞质近红外荧光信号，表明探针在病理条件下能够被激活。值得注意的是，N-乙酰半胱氨酸（NAC）预处理可使NIRF信号降低72%，这与NAC通过促进谷胱甘肽合成来清除ROS的机制一致。进一步的组织病理学分析也证实了Cy-PITC信号与顺铂诱导的肾小管损伤程度之间的相关性，表明其对AKI过程中动态氧化还原变化具有良好的响应能力。

随后，我们将Cy-PITC应用于小鼠模型，以评估其在体内成像中的表现。通过尾静脉注射Cy-PITC（100 μL，0.2 mM），并监测顺铂（20 mg/kg?1）处理后24小时和48小时的小鼠肾脏荧光变化。结果显示，肾脏中的荧光强度随着时间呈递增趋势，并在60分钟内达到峰值，随后保持稳定。与对照组相比，顺铂处理后的小鼠肾脏表现出显著的荧光增强，而对照组的小鼠主要器官在Cy-PITC注射后荧光信号未发生变化。此外，我们还观察到肝组织中荧光信号的增加，这与顺铂引起的肝部氧化应激有关。这表明，HClO在顺铂诱导的药物模型中不仅在肾脏中生成，还可能在其他器官中存在。因此，基于尿液的分析方法相较于体内成像更为特异和优选。

在成功验证了Cy-PITC在小鼠模型中的性能后，我们进一步将其应用于临床AKI诊断。我们招募了10名健康个体和30名AKI患者，并详细记录了他们的生化参数（见补充信息Table S3）。Cy-PITC的诊断流程非常简便，仅需将尿液与探针孵育（<2分钟），并使用智能手机进行荧光成像，即可实现快速、便携的点对点诊断。这一方法无需复杂的仪器和专业人员，特别适用于资源有限的环境，使得AKI的早期诊断更加可行。临床分析结果显示，AKI患者的尿液中Cy-PITC的荧光强度比健康对照组提高了5.4倍，表明其在临床样本中的有效性。同时，Cy-PITC能够有效区分AKI患者与其他非肾性炎症性疾病（如败血症）患者，显示出更高的荧光强度，这一结果与肾部特异性HClO生成的机制一致。

此外，Cy-PITC的荧光信号与血清肌酐（Scr）之间表现出显著的正相关性（Pearson's r = 0.77），但与肝功能或电解质指标之间没有显著相关性（见补充信息Fig. S20），进一步验证了其肾特异性。对一名恢复期AKI患者的纵向监测显示，ΔScr和尿液中Cy-PITC的荧光强度均呈同步下降趋势，表明其能够反映肾脏功能的实时改善。通过ROC分析，我们进一步验证了Cy-PITC在AKI诊断中的高准确性（AUC = 1.0），进一步突显了其在临床中的应用价值。

综上所述，我们成功开发了一种“样本到答案”（sample-to-answer）的AKI检测方法。Cy-PITC能够快速、选择性地检测尿液中的痕量HClO/ClO?，其反应时间仅为1分钟，且可使用普通相机进行捕捉。与传统的血清肌酐检测相比，基于尿液的分析结果更加一致，且无需复杂设备和专业人员，使得AKI的早期诊断更加高效和便捷。这一技术的突破为AKI的快速、准确诊断提供了新的解决方案，有望在临床实践中广泛应用，尤其是在资源有限的地区，为患者提供更及时的医疗干预。