EryA-mCherry蛋白检测凋亡细胞质膜上心磷脂的暴露情况

《The FEBS Journal》：Sensing of cardiolipin exposure on plasma membranes of apoptotic cells by EryA-mCherry protein

凋亡标记；cardiolipin（CL）；特异性结合；annexin V-FITC；荧光标记；膜磷脂

　　Erylysin A（EryA）是一种由可食用的鸡枞菌（*Pleurotus eryngii*）产生的aegerolysin蛋白。该蛋白能够强烈地与无脊椎动物特异性膜鞘脂——神经酰胺磷乙醇胺（CPE）相互作用。近期研究表明，一种荧光标记的EryA变体（EryA-mCherry）能够与含心脏磷脂（CL）的人工脂质膜和细菌脂质膜发生结合。CL是一种四酰基化的甘油磷脂，由两个磷脂酸通过甘油桥连接而成。它具有一个带负电的较小头部基团和一个较大的疏水区域，这些特性使其呈现出锥形结构，并对具有高负曲率的膜区域有强烈的偏好。在细菌中，CL主要定位于极性区域和分裂位点，而在真核细胞的线粒体膜中，它则主要朝向膜基质侧，占线粒体总磷脂的25%。此外，CL在线粒体中发挥着关键作用，参与维持嵴的形态、组织氧化磷酸化复合体以及其与超复合体（呼吸体）的结合。在线粒体之外，CL在程序性细胞死亡（凋亡）过程中也会被重新分布到细胞膜上，作为受损线粒体的“吃我”信号。

随着研究的深入，CL的异常水平已被与多种病理生理状况相关联，包括巴特综合征、心血管和代谢疾病、癌症以及神经退行性疾病。这些发现表明，CL可能成为这些疾病的诊断和监测的潜在生物标志物，甚至可以作为治疗目标。然而，目前检测CL主要依赖于先进的分析方法，如液相色谱-质谱联用、质谱成像、离子迁移率光谱和放射性标记。这些方法虽然准确，但往往成本较高，操作复杂，难以在临床环境中广泛应用。因此，开发一种简便、成本效益高且特异性强的荧光探针，成为研究的一个重要方向。

最近，研究人员发现了一种荧光标记的重组aegerolysin蛋白EryA-EGFP，能够特异性地与人工脂质囊泡中的CL结合，并在表达于*Escherichia coli*时，会聚集在CL富集的膜区域（如细胞膜的胞质侧）。这一发现激发了我们进一步研究EryA-mCherry与CL结合的强度和特异性，以及其作为凋亡细胞表面CL标记的潜力。我们还希望通过与另一种已知的凋亡标志物——荧光标记的Annexin V-FITC进行比较，评估EryA-mCherry在细胞膜识别方面的表现，并将其与抗CL抗体的标记进行关联。

在人工脂质囊泡的实验中，我们观察到EryA-mCherry与CL的结合具有高度的特异性，但其结合亲和力（Kd值为4.7 ± 1.6 μM）不如Annexin V-FITC（Kd值在纳摩尔浓度范围内）。这说明虽然EryA-mCherry能够特异性地识别CL，但其结合效率较低。同时，EryA-mCherry在与含CL的人工脂质膜结合时表现出比Annexin V-FITC更窄的结合范围，因为它不仅能够与CL结合，还与其它带负电的甘油磷脂（如磷脂酸、磷脂酰甘油、磷脂酰丝氨酸和磷脂酰肌醇）结合，但其结合强度明显低于Annexin V-FITC。此外，我们发现EryA-mCherry与Annexin V-FITC在凋亡细胞的膜结合区域具有较高的重叠度，这表明它们可能在某些膜区域有共同的结合偏好。

在哺乳动物细胞实验中，我们发现EryA-mCherry能够特异性地标记凋亡细胞的膜区域，特别是在细胞的胞质区域和膜泡（blebs）中。这种结合行为与抗CL抗体和Annexin V-FITC相似，表明EryA-mCherry可能是一个有效的凋亡细胞标记物。我们还通过荧光显微镜观察到，EryA-mCherry与Annexin V-FITC在凋亡细胞膜上的结合位置高度重合，其相关系数达到0.721，属于强相关。这表明EryA-mCherry与Annexin V-FITC在某些凋亡相关膜区域有相似的结合模式。

此外，我们发现EryA-mCherry在凋亡细胞膜上的结合行为与抗CL抗体高度一致，进一步支持其作为CL标记的潜力。我们还评估了EryA-mCherry在不同条件下的表现，包括化学诱导（如使用staurosporine）和物理诱导（如紫外线照射）的凋亡过程。结果显示，无论凋亡是由哪种方式诱导的，EryA-mCherry都能有效地标记凋亡细胞的膜区域。这表明其在不同类型的凋亡过程中具有广泛的应用前景。

然而，EryA-mCherry在某些情况下表现出较低的结合效率，这可能与其结构特性有关。通过圆二色光谱（CD）分析，我们发现EryA-mCherry的结构与未标记的EryA和mCherry的结构存在差异，这可能影响其结合能力。此外，我们还发现，EryA-mCherry与PlyB蛋白形成的复合物在渗透人工脂质囊泡时表现不佳，而未标记的EryA与PlyB复合物则表现出更强的渗透能力。这表明，荧光标记可能影响EryA-mCherry的膜穿透能力，可能与其与CL的结合特性有关。

总的来说，EryA-mCherry在人工脂质膜和哺乳动物细胞凋亡过程中均表现出对CL的高特异性结合能力，尽管其结合亲和力不如Annexin V-FITC。这些结果表明，EryA-mCherry可以作为一种新的凋亡标记物，用于检测凋亡细胞表面的CL。此外，EryA-mCherry与Annexin V-FITC在凋亡细胞膜上的结合模式相似，进一步支持其在凋亡研究中的应用价值。然而，EryA-mCherry的结合效率和标记能力仍需进一步优化，以提高其在生物医学研究中的实用性。未来的研究可以聚焦于开发更高效的荧光标记策略，以及探索EryA-mCherry在不同细胞类型和病理条件下的应用潜力。