一种新的Telonemia属和种的描述，以及基于新观察结果对其隐藏多样性的深入理解

《Journal of Eukaryotic Microbiology》：Description of a New Telonemia Genus and Species With Novel Observations Providing Insights Into Its Hidden Diversity

本研究通过分离和表征三个新的Telonemia菌株（包括新属Hyaliora molinica和物种Telonema blandense），重新分离Telonema subtile，并利用18S rRNA基因和全核糖体基因数据进行系统发育分析。形态学显示新物种具有独特的表面结构、不等长的鞭毛及食物泡动态变化，并发现新的伪足形成行为。研究揭示了Telonemia在真核生物进化中的关键地位，强调其生态功能在微生物食物网中的重要性，并指出多基因数据对完善分类所需的必要性。

　　Telonemia，这个在微生物真核生物中鲜为人知的类群，以其广泛的多样性而闻名，但其生物学特征和分类地位仍然存在许多未解之谜。尽管如此，该类群的分类学研究仍处于初级阶段，目前仅有三个属中的七个已知物种被描述，但估计还有数百种未被发现的类群。本研究通过分离和鉴定两个新菌株，包括一个新的属（Hyaliora molinica n. gen. n. sp.）和一个新的物种（Telonema blandense n. sp.），并重新分离了之前已知的Telonema subtile，同时结合新的行为观察。我们通过形态学测量和18S rRNA基因序列构建了系统发育树，以揭示这些菌株之间的差异。此外，还重点分析了其细胞生物学和结构特征，以探讨其潜在姐妹类群的进化关系。由于Telonemia不仅在分类学上具有重要意义，还在生态网络中扮演关键角色，某些物种在水生生态系统中分布广泛，因此本研究的发现有助于进一步探索该神秘类群的隐藏多样性与进化路径。

Telonemia，通常被称为“telonemids”，是一个长期以来缺乏系统研究的真核生物类群。它曾被认为是Sar超类群（包括Stramenopiles、Alveolata和Rhizaria）的姐妹类群（Adl et al., 2019），该超类群可能涵盖了约一半的真核生物多样性（Grattepanche et al., 2018）。然而，最近的系统发育基因组研究未能恢复TSAR超类群，而是将Telonemia置于Haptista的姐妹类群，尽管这种分类的支持度存在差异（Eglit et al., 2024；Torruella et al., 2025；Yazaki et al., 2022）。因此，这一类群的系统发育位置仍然存在争议。Sar和Haptista作为重要的真核生物类群，telonemids的存在为研究其形态特征和细胞创新提供了机会，同时也为理解真核生物的多样性演化提供了线索（Tikhonenkov et al., 2022）。

截至目前，Telonemia的描述物种仅有三个属中的七个，尽管它们最初是在一个世纪前被描述的。最早的物种是Telonema subtile（也被称为T. subtilis，同名异义），由Griessmann于1913年从海洋环境中分离出来（具体是在法国Roscoff和意大利Naples的粗培养的Ulva和红藻中），其细胞尺寸较小（约6–8微米），无色，椭圆形，具有坚硬的细胞体，无收缩囊泡，并且与其他已知的鞭毛生物没有明显的亲缘关系（Griessmann, 1913）。数十年后，另一项研究对这一物种进行了更详细的形态学描述，并错误地将其归入现已淘汰的Cyathomonadidae科（Cryptophyta，Chromista），由于其形态相似性（Hollande and Cachon, 1950），随后还有多项研究（V?rs, 1992, 1993）。直到2013年，才对T. subtile进行了更深入的描述，明确了其结构特征：细胞中含有线粒体、外排体、一种特殊的器官（telonemosome，被认为是一种包含未成熟鞭毛的囊泡）、细胞核、多层细胞骨架和粘附纤维（Yabuki et al., 2013）。时隔近一个世纪，从最初描述到分离和鉴定第二个物种T. antarcticum（后被重新命名为Lateronema antarctica，由于其与T. subtile在形态和基因上的差异），从而形成了第二个属（Cavalier-Smith et al., 2015）。随后，2022年的一项研究描述了三个新的Telonema物种（T. rivulare、T. papanine和T. tenere）以及两个新的Arpakorses属物种（A. versatilis和A. idiomastiga）（Tikhonenkov et al., 2022）。最近，Zlatogursky等人描述了Microkorses curacao，属于一个新属（Zlatogursky et al., 2025）。总的来说，这些仅占Telonemia多样性的一小部分，估计仍有超过一百种未被描述的海洋和淡水Telonemia类群（Br?te et al., 2010）。

目前，我们对Telonemids的了解主要来自于先前的研究，指出它们是吞噬性异养双鞭毛原生生物，呈梨形，鞭毛从细胞短突出的抗极性喙或触手处延伸（Klaveness et al., 2005；Shalchian-Tabrizi et al., 2006）。值得注意的是，一项后续研究（Tikhonenkov et al., 2022）将鞭毛极定义为“极”端，但在此研究中，我们将采用最初的描述。如前所述，其独特的结构特征也是该类群的共有特征（Yabuki et al., 2013；Klaveness et al., 2005）。这种复杂的细胞骨架，以及其他结构和形态，可能意味着Telonemids保留了其他姐妹类群中丢失的祖先性状（Klaveness et al., 2005）。

由于Telonemids在淡水和海洋生态系统中分布广泛且数量众多，它们很可能在生态系统中扮演重要的生态角色。它们以广泛的细菌和微至纳级浮游植物为食（Br?te et al., 2010），并且似乎无法在没有其真核猎物的情况下生存（Tikhonenkov et al., 2022）。这种摄食行为使它们成为微生物食物网中的重要消费者，有助于营养循环和能量流动。在本研究中，我们分离了三种新的Telonemids菌株，包括一个新属和一个新物种，来自地中海的海洋样本，同时还重新分离了T. subtile，来自南极的海洋样本。我们提供了这些菌株的详细形态和行为描述，并结合了形态学上的显著差异分析，以及基于现有18S rRNA基因序列构建的系统发育树。

在材料与方法部分，我们使用了稀释法从Blanes Bay微生物观测站（BBMO）采集的表层水样中分离出Hyaliora molinica n. gen n. sp.菌株BEAP0326和T. blandense n. sp.菌株BEAP0082。这些样本位于西北地中海海，距离海岸约1公里（41°40′ N, 2°48′ E），水深约20米，采集时间为2024年2月。H. molinica菌株的培养条件为17°C，使用RS培养基（营养成分P5与非营养成分P4的比例为1:50），并包含未知的原核生物和真核生物（包括Bicosoecida和MAST代表的18S rRNA序列，但未进行全面测序）。Hyaliora sp.（BEAP0010）也通过稀释法从同一采样点分离，但该培养物在进行形态学分析前就已死亡。T. blandense的培养条件为17°C，黑暗环境中使用RS培养基1:10，包含未知的原核生物和真核生物（包括MAST代表的18S rRNA序列，但未进行完整测序）。T. subtile菌株BEAP0314则从南极表层水样中分离，采集时间为2023年2月22日，水深约5米，使用RS培养基1:100保存。

我们对所有培养物进行了18S rRNA基因测序。每种培养物取50 mL样本用于18S克隆。细胞在离心20分钟（13000 × g）后被重悬于沉淀物中，使用DNeasy PowerSoil Pro试剂盒（QIAGEN）提取DNA。通过PCR使用通用真核生物引物（42F-1747R和82F-1732R）对18S rRNA基因进行扩增。扩增产物通过NZYGelpure试剂盒（NZYTech）纯化，使用TOPO-TA克隆试剂盒（Invitrogen）克隆，并通过LacZα互补法转化到大肠杆菌细胞中。阳性克隆被选择，并通过向量特异性引物（M13F-M13R）进行PCR扩增。测序工作由Eurofins Genomics使用Sanger测序完成。得到的序列通过Phred进行碱基调用，并通过Phrap进行组装，使用Consed导出共识序列。我们获得的三种菌株的18S rRNA基因序列（BEAP0010、BEAP0082、BEAP0314，每个为9个测序克隆的共识序列；BEAP0326为5个测序克隆的共识序列）已被提交至GenBank，访问号为PV654195-PV654198。这些序列通过BLAST与EukRibo版本1.0进行比对，以确认它们属于观察到的Telonemia菌株，而非其他真核生物。

为了确定新菌株在Telonemia系统发育树中的位置，我们构建了包含四个新序列、所有可用的Telonemia物种18S rRNA序列以及代表未描述多样性的环境克隆的18S rRNA比对。我们从GenBank（Sayers et al., 2025）和Jamy等人（2022）的长读长环境调查中获取了这些环境克隆。作为外群，我们使用了与Telonemia密切相关的两个真核生物类群（Haptophyta和Provora）。对于那些在EukProt中拥有转录组或基因组数据的类群，我们从组装的转录组contigs或基因组 shotgun序列中提取完整的18S rRNA序列，以确保最佳的18S rRNA覆盖和序列质量（见表S1）。我们还构建了第二个比对，涵盖更长的核糖体操作子（从18S rRNA的V4区域之前到28S rRNA的约三分之二位置），用于Telonemia内的TEL-1类群成员。它包括所有描述的TEL-1类群成员的核糖体操作子序列，以及Jamy等人（2022）数据集中的环境克隆。

两个比对均在BioEdit版本7.2.5中手动构建。对于18S rRNA序列，我们根据18S rRNA的二级结构模型手动修剪了模糊比对的位置。对于5.8S和28S rRNA序列，我们根据它们的二级结构模型进行了修剪。在第一个比对（仅18S rRNA）中，由于其包含更多远源类群的序列，需要排除更多的位置。相比之下，TEL-1类群的成员具有保守的序列，即使在18S和28S rRNA的最变异性区域也能对齐，因此需要修剪的位置非常少。随后，我们使用RAxML版本8.2.10（Stamatakis, 2014）通过最大似然法推断了每个数据集的系统发育树，使用GTRGAMMA模型，并通过快速自举算法（1000个伪复制）计算了内部节点的统计支持。最后，使用iTOL（Letunic and Bork, 2021）对树进行了可视化和编辑。

在形态学分析部分，我们通过差分干涉对比（DIC）显微镜和Zeiss Axiovert倒置显微镜（配备63×油浸透镜）采集了静态和延时图像。随后，使用Fiji软件（Schneider et al., 2012）对数字图像进行了处理。我们测量了细胞长度、宽度、食物囊泡直径和鞭毛长度，并使用R Studio（RStudio Team, 2020）对20个细胞进行分析。对于鞭毛长度分类，我们确定较长的可见鞭毛为“长鞭毛”，较短的为“短鞭毛”。我们使用了tidyverse（Wickham et al., 2019）、ggplot2（Wickham, 2016）和patchwork（Pedersen, 2024）进行数据分析和图表生成。为了识别三种菌株之间的差异，我们运行了ANOVA测试，显著性水平为0.05。我们通过Shapiro-Wilk检验和Bartlett检验检查了残差的正态性和方差齐性。在ANOVA显著的情况下，我们使用Tukey测试进行多重比较，以发现种间差异。

对于扫描电子显微镜（SEM）分析，我们使用3%的戊二醛溶液固定细胞，稀释于培养基中（25%浓度）。细胞在室温下孵育3小时，然后通过过滤接种到0.8微米孔径的膜上（WHA10417301，MERCK Chemicals and Life Science）。样品通过分级乙醇系列进行脱水，并使用液态二氧化碳在Leica EM CPD300单元（Leica Microsystems，奥地利）进行临界点干燥。干燥后的滤膜用胶体银固定，并在Q150R S（Quorum Technologies Ltd.）中进行金镀膜，然后在Hitachi S3500N扫描电子显微镜（日本Hitachi High Technologies Co. Ltd.）或Hitachi SU8600场发射扫描电子显微镜（日本Hitachi High Technologies Co. Ltd.）中进行观察，加速电压为5 kV。

在结果部分，我们构建了一个包含三种新菌株的系统发育树，以及所有当前可用的描述物种的18S rRNA序列和代表未描述多样性的环境克隆（图1a）。根据其18S rRNA序列，其中一种菌株（BEAP0314）对应于T. subtile，与T. subtile Tel-1（Tikhonenkov et al., 2022）完全一致。另外两个菌株可能也属于T. subtile，其序列中的差异可能是误差。第二种菌株（BEAP0082）也在T. subtile的属内分支，但与之前描述的物种分开，被鉴定为新物种T. blandense。第三种菌株（BEAP0326）被提议为新属Hyaliora molinica，因为我们的18S系统发育分析表明它代表了一个独立的谱系，不与其他描述的属分支。它与三个18S rRNA序列一起聚类：一个来自第四菌株（BEAP0010），该菌株在形态学分析前就已死亡；一个来自中国河流河口的GenBank环境克隆（PQ770954）；以及一个来自Jamy等人（2022）数据集的长读长环境克隆，来自北海的表层水样，水深5米。由于仅使用18S rRNA序列难以解析Telonemia内部关系（如图1a所示，许多内部节点的自举支持较低），我们构建了第二个数据集，涵盖更长的核糖体操作子，与Jamy等人（2022）数据集中的完整片段匹配。在此分析中，我们专注于TEL-1类群，以增加可用于推断树的无歧义对齐位置（图1b）。该分析确认了新属Hyaliora（由Jamy等人数据集中的环境克隆c-4422_Otu0327_11代表）独立于已描述的物种，并不能归入任何已描述的属。然而，它还显示了两个Arpakorses物种的分支，其中模式种A. versatilis被弱置为T. subtile的姐妹属，而A. idiomastiga被弱置为Microkorses的姐妹属。

在细胞大小和鞭毛长度方面，我们观察到物种间的差异和种内变化。T. subtile的细胞尺寸明显大于T. blandense和H. molinica（长度：p=10??；宽度：p=10??），而T. blandense和H. molinica之间没有显著差异（图2a,b）。如预期的那样，食物囊泡直径在三种菌株之间没有显著差异（p=0.3，图2c），因为它们可能依赖于食物的可得性和猎物的大小（Tikhonenkov et al., 2022）。

图3展示了三种菌株的长鞭毛和短鞭毛长度分布（将较长的鞭毛视为“长鞭毛”，较短的视为“短鞭毛”）。多重比较显示，T. subtile的平均鞭毛长度最长，其次是T. blandense和H. molinica。值得注意的是，H. molinica和T. subtile都表现出显著不均等的鞭毛（p=0.009），而T. blandense的鞭毛长度似乎相等。

从外部形态、行为和生态角度来看，我们观察到所有三种菌株在没有其他真核生物的情况下无法生存，可能作为猎物。这一现象在其他Telonemia菌株中也有报道（Tikhonenkov et al., 2022）。在Hyaliora molinica中，细胞呈滴状，具有一个位于抗极性部位的喙，包含一个位于喙末端的细胞口（图5c,e）。细胞长度为5.7–7.8微米，宽度为2.8–5.4微米。两个无节鞭毛从抗极性部位延伸，其中一条（3.4–5.1微米）明显短于另一条（5.3–8.5微米）（图3和图4a）。我们的图像中未检测到mastigonemes。在七个被扫描电子显微镜分析的细胞中，我们观察到许多鞭毛基部的突起（图5c），尽管这可能是样品制备过程中的伪影。所有细胞表面都可见到凹凸结构（图5b,d,e），并在一侧可见到一个凹陷（图5e），这是Telonemids的一个显著特征（Tikhonenkov et al., 2022；Shalchian-Tabrizi et al., 2006）。食物囊泡位于细胞的中心和后部之间（图4a,c），在摄食良好的细胞中较为明显，如Klaveness等人（2005）和Tikhonenkov等人（2022）在其他Telonemia物种中所报道的那样。在这些摄食良好的细胞中，细胞形状更加圆润，而不是梨形。细胞游泳时围绕其纵轴旋转，鞭毛朝远离运动方向延伸，但在静止细胞中，鞭毛会围绕细胞体，方向一致（图4b）。这种行为在T. subtile的属中被观察到，但在其他属中未见（Tikhonenkov et al., 2022）。细胞分裂是纵向的，与所有其他描述的Telonemids一致。

关于T. blandense，我们观察到其具有一个长的后部伪足，用于附着在基质上（图4e，视频S1）。它们也以鞭毛朝后的方式游泳，并在不移动时将鞭毛围绕细胞体。细胞分裂被观察为纵向的（图4g）。有趣的是，在具有显著囊泡的细胞中，我们观察到一种新奇的行为：它们似乎会排出囊泡，以便在分裂过程中腾出细胞质内的空间（图4h–m）。这种现象可能涉及外排器官的释放，因为这些结构在T. subtile的超微结构分析中被报道过（Yabuki et al., 2013），以及在Arpakorses属中被观察到（Tikhonenkov et al., 2022）。

从生态角度来看，有证据表明Telonemids在海洋生态系统中广泛分布且数量众多（Klaveness et al., 2005）。先前的研究将Telonemids描述为吞噬性生物，以广泛的细菌和微至纳级浮游植物为食（Br?te et al., 2010），这意味着它们可能在生态系统中作为类似或更小尺寸微生物的消费者，发挥重要作用。由于我们研究中描述的三种物种在没有其他较小的真核生物的情况下无法存活，Telonemids可能依赖于这些捕食-被捕食动态。类似的现象在Arpakorses属中也已被观察到（Tikhonenkov et al., 2022）。

总之，本研究进一步揭示了一些隐藏的Telonemia多样性，该类群仍然是一个神秘的门，可能在真核细胞的进化史上具有重要意义。为了更全面地了解这一类群的多样性，需要在全球范围内的海洋和淡水生态系统中进行更广泛的环境采样，以建立更多未描述的谱系的克隆培养物，并继续获取已描述的Telonemids的新信息。此外，还需要从克隆培养物和环境样本中获取更多的基因组和转录组数据，以构建更坚实和详细的系统发育树，从而全面理解这一神秘门的丰富生物多样性。