具有共同祖先核心结构域的F1-ATP酶在定子环中的功能与结构表征

《Protein Science》：Functional and structural characterization of F1-ATPase with common ancestral core domains in stator ring

ATP合酶F1的进化起源和催化机制研究表明，通过祖先序列重建和融合关键结构域构建的chimeric F1酶表现出六步旋转机制，支持其原初形式为六步，而三步和九步变体可能是在进化中形成的。

　　本研究聚焦于F1-ATP酶的进化起源及其旋转步进机制。F1-ATP酶是一种广泛存在于生物体中的关键酶，其主要功能是催化ATP的合成或水解。在自然界中，已知的F1-ATP酶展现出多种旋转步进模式，包括3步、6步和9步循环。然而，这些模式的进化来源仍然存在疑问。为了探索这一问题，研究人员采用祖先序列重建（Ancestral Sequence Reconstruction, ASR）技术，推测出一种可能的祖先F1-ATP酶的催化β亚基和非催化α亚基，并将这些关键功能区域融合到一种热稳定性较高的F1（来自Bacillus PS3的TF1）中，从而构建出一个稳定的嵌合酶。通过冷冻电镜（Cryo-EM）分析，研究人员发现了两种截然不同的构象状态——结合态和催化态，这两者之间的γ亚基旋转角度约为34度，表明该酶可能遵循六步旋转机制，与已知的六步F1-ATP酶的旋转模式相似。进一步的单分子旋转实验则证实了这一假设，该嵌合酶在ATP和缓慢水解的ATP类似物ATPγS的作用下表现出每圈六次停顿，每次停顿的旋转角度约为32.1度，尽管结合态的停留时间显著延长。这些发现支持了F1-ATP酶最初是一种六步旋转酶的假设，并表明其在进化过程中分化为3步、6步和9步的形式。

F1-ATP酶的结构由两个旋转电机Fo和F1组成。F1作为ATP驱动的电机，主要负责催化反应，而Fo则嵌入膜中，通过质子的跨膜移动驱动F1的逆向旋转，从而完成ATP的合成。F1由α3β3γ1构成，其中γ亚基嵌入在由交替的α和β亚基组成的异六聚体定子环中。每个β亚基上存在一个催化位点，而β-α界面虽然也结合ATP，但并不具备催化活性，因此α亚基被称为“非催化亚基”。在催化过程中，三个β亚基以协调的方式发生构象变化，进而驱动γ亚基的单向旋转。

近年来，通过单分子旋转实验，研究人员对F1-ATP酶的旋转机制有了更深入的理解。以热稳定性高的TF1为例，其基本旋转步长为120度，随后被解析为80度和40度两个子步。结合态和催化态分别对应这两个子步，标志着酶在结合ATP和催化水解过程中的不同状态。然而，不同物种的F1-ATP酶表现出不同的旋转步数。例如，哺乳动物线粒体F1（hMF1和bMF1）在每圈中表现出九次停顿，而Paracoccus denitrificans的F1（PdF1）则表现为三次停顿。这种差异与F1的定子环中c亚基的数量有关：六步F1通常与c10环结合，九步F1则与c8环结合，而三步F1则与c12环结合。这表明F1的旋转步数可能受到某些机械或生理限制的影响。

为了进一步探索哪一部分的亚基决定了F1的旋转步数，研究人员之前构建了多种混合F1-ATP酶，其亚基来源于不同的物种，包括TF1、bMF1和PdF1。这些实验表明，旋转速度主要由β亚基的来源决定，但没有发现单一的规则来解释所有混合酶的旋转步数。然而，当混合酶包含来自PdF1的亚基时，其旋转步数总是保持为三步，这说明某些亚基可能对旋转步数具有决定性作用。尽管大多数F1-ATP酶在每圈中表现出六次停顿，但哺乳动物线粒体F1和PdF1却表现出不同的步数，这表明F1-ATP酶在进化过程中可能经历了功能上的分化。

在进化生物学中，F型ATP酶与V/A型ATP酶密切相关。V/A型ATP酶存在于某些原核生物和古菌中，其结构与真核生物的V型ATP酶相似，这表明这些酶可能共享某种保守的结构框架。在本研究中，V型和A型ATP酶被统称为V/A型ATP酶，并用于构建进化树。分子进化分析表明，F1-ATP酶和V1-ATP酶的祖先可能源自一个共同的旋转ATP酶，该酶具有由非催化和催化亚基组成的异六聚体定子环。此外，研究还提出，这种共同的祖先可能与III型分泌系统（T3SS）的ATP酶具有进化关系，因为T3SS的ATP酶也形成六聚体结构。

为了探索祖先F1-ATP酶的功能，研究人员使用ASR技术重建了催化和非催化亚基的祖先序列，并尝试将这些序列用于实验研究。然而，由于多亚基复合物的结构复杂性，祖先序列的表达和功能验证存在较大挑战。因此，研究人员采用了一种策略，即将祖先序列的功能核心区域整合到现有的热稳定性F1（TF1）中，构建出一个稳定的嵌合酶。通过这种方式，研究人员成功表达了F1的祖先核心区域，并将其命名为F1^anc_core。该嵌合酶在ATP存在的情况下表现出一定的ATP酶活性，尽管其活性显著低于TF1。冷冻电镜分析显示，F1^anc_core在两种不同的构象状态（结合态和催化态）中保持了结构的相似性，这表明其可能遵循与TF1相同的六步旋转机制。

然而，F1^anc_core的旋转行为表现出一些独特之处。在所有测试的ATP浓度下，该嵌合酶表现出三步旋转，这与已知的六步F1酶不同。研究人员推测，这种现象可能是由于结合态的停留时间较长，从而掩盖了催化态的短暂停顿。为了验证这一假设，研究人员使用ATPγS进行单分子旋转实验，发现该嵌合酶在ATPγS作用下表现出六步旋转，与冷冻电镜分析结果一致。通过比较ATP和ATPγS的停顿位置，研究人员确定了三种共同的停顿点对应结合态，而另外三种则对应催化态，两者之间的旋转角度约为32.1度，与冷冻电镜测得的约34度接近。

这些结果表明，祖先F1-ATP酶可能原本具有六步旋转机制，而现代F1-ATP酶在进化过程中分化为三步、六步和九步形式。从结构角度来看，这种分化可能与定子环中c亚基的数量变化有关，六步F1通常与c10环结合，而三步F1则与c12环结合，九步F1则与c8环结合。这可能反映了某些生理或能量转换上的适应性变化。例如，LUCA（最后的普遍祖先）可能已经具备了能够维持足够质子动力势（pmf）的紧密膜结构，以支持ATP合成所需的能量转换。

从工程学的角度来看，本研究提供了一种新的策略：利用现有的热稳定性F1（如TF1）作为结构框架，整合祖先或设计的催化区域，从而构建出具有祖先功能的酶。这种方法不仅有助于理解F1-ATP酶的进化历史，还可能为其他旋转酶的祖先序列研究提供借鉴。未来的研究可以进一步探讨祖先F1的功率-步进动态，并与嗜热和中温F1酶进行比较，以揭示其在能量转换方面的不同机制。此外，研究具有c15环的光合F-ATP合成酶的旋转步数是否减少，也可能是进一步理解旋转酶普遍机制的重要方向。

本研究的实验方法包括多个步骤。首先，通过NCBI数据库获取蛋白序列，并使用KFS数据库进行扩展，以支持ATP酶的研究。然后，通过BLASTP搜索收集同源序列，并进行多序列比对，构建进化树。在进化树的基础上，利用codeml和GASP程序进行祖先序列的预测，并通过冷冻电镜和单分子旋转实验验证其功能。实验中使用的TF1被用作结构框架，其N端结构域被保留，而C端结构域和核苷酸结合结构域则被替换为祖先序列。这种嵌合设计使得F1^anc_core能够在实验室条件下稳定表达，并展现出与现代F1相似的旋转机制。

为了评估F1^anc_core的分子量，研究人员使用了尺寸排阻高效液相色谱（SEC-HPLC）技术，并通过构建校准曲线进行计算。实验中使用的色谱柱在25°C下运行，移动相为含有100 mM NaCl的50 mM HEPES-KOH缓冲液。通过记录标记蛋白的保留时间，并绘制其分子量与保留时间的对数关系，研究人员确定了F1^anc_core的分子量，并通过三次测量验证了其可重复性。

在ATP酶活性测定中，研究人员在25°C下使用特定缓冲液进行实验，其中包含50 mM Hepes-KOH、50 mM KCl、3 mM MgCl?以及ATP再生系统。通过监测NADH的吸光度变化，计算ATP酶的活性，并通过加入LDAO（一种能够缓解ADP抑制的试剂）来评估酶的活性变化。实验结果显示，F1^anc_core的ATP酶活性约为TF1的十分之一，这可能与样本的异质性有关，即部分样本缺乏γ亚基或αβ对。

为了获得F1^anc_core的结构信息，研究人员使用冷冻电镜技术进行数据采集和处理。首先，将纯化的F1^anc_core样品涂布在充满液态乙烷的网格上，并在200 kV的透射电镜下进行初步筛选。随后，使用300 kV的Titan Krios透射电镜进行更详细的成像，并通过Gatan BioQuantum能量滤波器和K3相机获取高质量数据。为了减少方向性偏差，研究人员在倾斜角度为20°至40°的条件下记录了电影微图像，并利用CryoSPARC软件进行图像处理和优化。通过二维分类和三维分类，研究人员识别出了不同的蛋白构象，并对这些构象进行了非均匀精修，以获得更精确的结构模型。

模型构建过程中，研究人员利用Coot和PHENIX软件进行结构精修，并以TF1的结合态和催化态冷冻电镜结构（PDB ID: 7L1Q和7L1R）作为模板。最终的结构模型通过DeepEMhancer软件进行优化，以提高分辨率和可解释性。通过计算γ亚基在结合态和催化态之间的旋转角度，研究人员确认了其约为34度，与TF1的旋转角度相似。

单分子旋转实验则采用40 nm金纳米颗粒作为探针，并在激光暗场显微镜下进行观测。实验中，研究人员通过改变ATP浓度，观察到F1^anc_core在不同条件下表现出一致的三步旋转模式，这可能与结合态的停留时间较长有关。在ATPγS的条件下，F1^anc_core表现出六步旋转，与冷冻电镜分析结果一致。通过缓冲液交换实验，研究人员进一步确认了结合态和催化态的停顿位置，并计算了它们之间的旋转角度差。这些结果表明，F1^anc_core的旋转机制与TF1相似，尽管其结合态的停留时间显著延长，可能涉及某些特殊的反应步骤。

总的来说，本研究通过祖先序列重建和实验验证，揭示了F1-ATP酶的原始旋转机制，并提出了其在进化过程中可能的分化路径。研究不仅加深了我们对F1-ATP酶功能和结构的理解，还为探索更古老的旋转酶提供了新的方法和思路。未来的研究可以进一步探讨这些酶在不同生理条件下的行为，以及它们在更早的进化阶段可能具备的功能。此外，对其他相关蛋白的祖先序列进行研究，可能会揭示更多关于生命早期代谢机制的线索。