一种可通过光切换调控的HaloTag，用于实现对活细胞中荧光现象的时空控制

《ANGEWANDTE CHEMIE-INTERNATIONAL EDITION》：A Photoswitchable HaloTag for Spatiotemporal Control of Fluorescence in Living Cells

光控化学遗传学荧光系统psHaloTag的开发及其在活细胞成像中的应用。通过融合光响应的AsLOV2蛋白结构域与自标签HaloTag蛋白，构建了可逆调控深红荧光的psHaloTag系统，实现了在活细胞中精确的空间和时间光控荧光切换，支持单分子定位显微术（SMLM）的应用。

　　光敏荧光探针，其荧光发射可以借助光进行调控，在先进的生物成像中具有重要作用，使得研究人员能够对分子特征进行精确的时空追踪，并支持超分辨率显微成像技术。虽然不可逆的光激活荧光探针已经被广泛研究和应用，但能够多次被重新激活的可逆报告系统仍然非常有限。目前，大多数应用于生物样本的光可逆探针依赖于荧光蛋白，但这些蛋白在深红色光谱区域通常表现出较低的亮度和光稳定性，对pH值和氧气浓度也较为敏感。因此，合成光可逆荧光探针具有更高的吸引力，但其设计和优化过程往往较为复杂。基于这些挑战，本文提出了一种“化学遗传学”方法，通过将光敏蛋白域整合到HaloTag自标记蛋白中，设计出一种可调控的、可光切换的HaloTag（psHaloTag），从而实现对结合荧光染料的荧光发射的控制。

HaloTag是一种被广泛用于生物标记的蛋白，其结构允许与特定的荧光染料形成高亲和力的结合。这些染料通常以非荧光的闭合状态存在，一旦与HaloTag结合，其环境的变化会促使染料进入荧光状态，从而产生显著的荧光增强。这一特性已经被用于设计基于构象变化的化学遗传学生物传感器。本文则进一步利用这一原理，将一个光响应蛋白域——来自小麦光敏蛋白（AsLOV2）——引入到HaloTag中，使其能够通过光诱导的构象变化，调节结合染料的荧光状态。AsLOV2是一种小型的蛋白质，含有FMN辅因子，其结构由两个终端α螺旋组成，即小的N端A’α螺旋和大的C端Jα螺旋。当受到450纳米波长的光照射时，AsLOV2会形成一个稳定的光加成物，导致Jα螺旋的展开和蛋白构象的变化。这种变化是可逆的，在黑暗中会自发恢复至原始状态。通过将AsLOV2的结构域嵌入HaloTag，研究人员成功构建了一种新型的可光切换探针系统，其在光照条件下能够显著增强荧光信号，而在黑暗中则保持较低的荧光水平。

在构建psHaloTag的过程中，研究人员首先使用了AsLOV2的一个截短版本（sAsLOV2），并将其插入到HaloTag的特定位置，以确保其与荧光染料的相互作用。他们选择了JF635-HTL作为荧光染料，因为其与HaloTag结合后能产生高达113倍的荧光增强效果，并且已被成功用于构建多种生物传感器。为了优化系统性能，研究人员通过多轮定点饱和诱变，对HaloTag的特定区域进行改造。例如，通过引入E143W和A285W等突变，显著提高了荧光切换的效率。最终，研究人员筛选出两个最佳变体：psHaloTag1a和psHaloTag1b。这两个变体在黑暗状态下表现出较低的荧光，并且在光照条件下能够实现显著的荧光增强，其荧光切换的动态范围和可逆性均得到验证。

在体外实验中，psHaloTag1a和psHaloTag1b的荧光切换特性得到了详细评估。实验结果显示，psHaloTag1a在光照后能够实现高达4.6倍的荧光增强，而psHaloTag1b则达到3.5倍。此外，这两个变体在黑暗中能够完全恢复其原始状态，显示出良好的可逆性。研究人员还通过不同的荧光染料（如JF635、JF630和MaP系列染料）测试了系统的可调性。结果显示，不同的染料会导致不同的荧光增强效果，例如JF630-HTL在光照条件下能够实现高达7倍的荧光增强，而MaP系列染料的增强效果则相对较小。这些结果表明，通过调整染料类型，可以灵活调控psHaloTag的性能，包括亮度、荧光增强比以及切换速度。

在活细胞中的表现同样令人满意。研究人员将psHaloTag1a与不同的定位标签（如H2B、TOMM20和LifeAct）结合，并在U2OS细胞中进行表达和标记。实验结果表明，psHaloTag在活细胞中能够实现对目标分子的可逆荧光调控，并且具有良好的时空控制能力。例如，在光照条件下，psHaloTag能够显著增强特定细胞器的荧光信号，而在黑暗中则迅速恢复至原始状态。此外，psHaloTag在单分子定位显微成像（SMLM）中的应用也得到了验证。通过将psHaloTag与自发闪烁的荧光染料结合，研究人员能够精确控制单分子荧光探针的发射密度，从而提高SMLM的成像质量。这一系统能够在不依赖特殊缓冲液或光照条件的情况下实现对活细胞中分子的高分辨率成像，且其亮度和荧光增强特性在不同条件下保持稳定。

psHaloTag的开发不仅拓宽了光控荧光探针的应用范围，还为动态成像提供了新的工具。该系统能够通过光信号调控荧光探针的发射状态，从而实现对细胞内分子的精确标记和追踪。其高亮度、良好的可逆性和广泛的适用性，使其成为一种极具潜力的生物成像工具。此外，psHaloTag的结构分析也揭示了其工作原理。通过晶体结构的解析，研究人员发现psHaloTag的结构由HaloTag和AsLOV2两个部分组成，其中Jα螺旋与HaloTag的结构紧密相连，确保了构象变化能够有效地传递到荧光染料上。这一结构特征使得psHaloTag能够在光照条件下，通过蛋白构象的改变，显著增强荧光信号。

未来，研究人员计划进一步优化psHaloTag的性能，包括通过定向进化和结构导向工程提高其荧光增强比和切换速度。此外，他们还希望通过引入光学可逆的光敏结构域，使系统能够在更广泛的应用场景中实现更灵活的时空调控。psHaloTag的成功开发不仅展示了化学遗传学方法在荧光调控方面的潜力，也为超分辨率显微成像和动态生物过程的研究提供了新的可能性。随着对这一系统的深入研究和改进，psHaloTag有望成为生物成像领域的重要工具，推动对细胞内分子动态行为的更深入理解。