利用高效且不含半胱氨酸的分裂内含子进行三段蛋白质标记：该内含子通过计算预测聚集特性而被鉴定出来

《ANGEWANDTE CHEMIE-INTERNATIONAL EDITION》：Three-Segment Protein Labeling Using a Highly Efficient and Cysteine-Less Split Intein Identified with Computational Prediction of Aggregation Properties

本文通过计算序列分析预测split intein的聚合倾向，发现LCGC14新型高效无半胱氨酸split intein，并与CLm正交，实现三段蛋白串联连接及选择性化学标记，拓展了蛋白质工程应用范围。

　　这篇文章介绍了一种利用分裂intein（split intein）进行蛋白质工程的新方法，特别是在蛋白质拼接效率和化学标记方面的突破。通过计算序列分析技术，研究者们成功预测了分裂intein片段的聚集倾向，并进一步筛选出一种具有高拼接效率的新型无半胱氨酸（cysteine-less）分裂intein——LCGC14。这一成果不仅拓宽了蛋白质工程的应用范围，还为在氧化环境下进行蛋白质修饰提供了新的可能性。

分裂intein是一种特殊的蛋白质，其结构被分割成两个部分，分别位于不同的前体蛋白上。当这两个片段在合适的条件下结合时，它们能够催化蛋白质拼接反应，将前体蛋白的两端连接起来，形成完整的成熟蛋白。这种技术在蛋白质重构、定点标记以及条件激活等领域具有重要应用价值。然而，传统的分裂intein筛选方法依赖于逐一进行生化表征，过程繁琐且耗时。因此，研究者们希望开发一种更高效、更便捷的筛选策略，以减少实验工作量并提高发现效率。

研究团队发现，分裂intein的拼接效率与片段的聚集倾向之间存在负相关关系。这意味着，如果某个片段更容易形成聚集，那么它的拼接效率可能较低。为了验证这一假设，他们对三种新的无半胱氨酸分裂intein候选者进行了计算预测，并通过实验手段进一步分析其聚集行为。其中，LCGC14表现出极低的聚集倾向，且其拼接效率接近定量，这使其成为一种理想的分裂intein。这一发现为后续的蛋白质拼接研究提供了重要的理论依据，并表明基于序列的预测方法可以成为筛选高效分裂intein的新工具。

此外，研究者们还探讨了两种分裂intein之间的正交性（orthogonality）问题。正交性指的是不同分裂intein之间无法相互拼接，从而允许在不同条件下分别处理各个蛋白片段。通过实验，他们验证了LCGC14与CLm分裂intein之间的正交性，证明这两种intein可以在同一系统中协同使用，而不会发生交叉拼接。这一特性使得新的三段式蛋白质拼接方案成为可能，每个蛋白段可以独立进行化学修饰，例如使用半胱氨酸特异性生物偶联技术或在氧化条件下进行标记。

为了展示这种新方法的实际应用，研究团队设计了一个三段式蛋白质标记实验，使用LCGC14和CLm两种正交的无半胱氨酸分裂intein来构建一个荧光标记的三模块非核糖体肽合成酶（NRPS）。他们通过在中间模块中引入特定的半胱氨酸，使得荧光探针能够被定向标记，并通过生物偶联反应实现精准的荧光标记。实验结果显示，这种方法能够成功生成具有特定标记的蛋白质，从而用于研究蛋白质结构变化和模块间的相互作用。此外，他们还展示了另一种应用：在三个不同的蛋白段中分别使用不同的荧光探针进行标记，进一步拓展了该技术的适用范围。

这一研究不仅为蛋白质拼接技术提供了新的工具，还揭示了分裂intein拼接效率的潜在影响因素。通过计算序列中的聚集倾向，研究者们能够快速筛选出具有高拼接效率的候选intein，避免了繁琐的实验过程。此外，LCGC14的发现表明，基于序列的预测方法可以成为一种有效的筛选策略，从而推动蛋白质拼接技术的发展。未来，随着更多数据的积累和方法的优化，这种预测方法有望成为发现高效分裂intein的重要手段，为蛋白质工程和生物技术提供更广泛的应用前景。

研究团队还提到，分裂intein的正交性对于开发新的蛋白质编辑技术至关重要。例如，在氧化环境中进行蛋白质修饰通常需要避免半胱氨酸的氧化，而LCGC14和CLm这两种无半胱氨酸的分裂intein则能够满足这一需求。它们的正交性不仅使研究人员能够在不同条件下分别处理各个蛋白段，还为在复杂环境中进行蛋白质组装提供了新的思路。这种技术的应用范围有望进一步扩大，特别是在需要避免使用还原剂的场景中。

综上所述，这项研究通过计算方法和实验验证相结合，成功筛选出一种高效的无半胱氨酸分裂intein，并展示了其在蛋白质工程中的广泛应用。这种方法不仅提高了分裂intein的筛选效率，还为未来的蛋白质修饰和功能研究提供了新的工具。随着相关技术的不断发展，分裂intein在生物技术领域的应用前景将更加广阔。