在同一栖息地中生活的本地豆科植物和入侵性豆科植物之间，可培养的种子内生菌群落是否存在差异？

《Plant Biology》：Do culturable seed endophyte communities differ between native and invasive Fabaceae sharing the same habitat?

入侵物种Acacia与本土Fabaceae植物种子内生微生物的多样性及功能研究。通过16S和ITS测序，比较沙丘与森林环境中入侵与本土植物种子内生菌的丰富度、多样性及功能。发现入侵物种（如Acacia melanoxylon、Acacia saligna）具有更丰富的微生物群落（Dune中23 OTU，Forest中39 OTU），并与本土物种共享部分功能菌（如Bacillus、Penicillium）。环境（沙丘vs森林）显著影响微生物群结构，沙丘中入侵与本土物种微生物群相似性更高。功能分析显示代谢、生物防治及激素调控功能普遍存在，可能增强种子萌发能力。

　　植物入侵是全球生物多样性保护面临的重要挑战之一，常常与其他威胁如土地利用变化、农业活动、生物资源利用以及气候变化相互作用（Lughadha 等，2020）。外来入侵植物的引入会对生态系统的结构和功能产生深远影响，例如通过降低植物多样性、争夺资源和显著改变原生植物的物理和/或化学环境（Vilà 等，2011；Simberloff 等，2013；Kaul & Wilsey，2021）。然而，这些影响的严重程度因入侵植物的特性以及原生植物群落的抵抗力和多样性而异（Levine & D'Antonio，1999；Ibá?ez 等，2021；Rilov 等，2024）。因此，理解促进植物入侵成功的关键因素对于预测和管理新物种的引入风险以及控制已入侵物种的扩散具有重要意义。以往的研究主要集中在与入侵历史相关的上下文依赖效应，如种群数量和停留时间（Lockwood 等，2005；Wilson 等，2007），以及物种的系统发育、生物地理学和功能特性（Py?ek & Richardson，2006；van Kleunen 等，2010；Gallagher 等，2015）。

澳大利亚的刺槐属（Acacia）植物已被广泛引入世界各地，并且其中一些已成为入侵物种。这些植物对本地物种的多样性造成了严重影响，改变了营养循环、水资源分布和火灾频率（Marchante 等，2003；Marchante 等，2008；Ulm 等，2017；Werner 等，2010；Le Maitre 等，2011）。鉴于这些严重的生态影响，Acacia 被广泛用作入侵生态学研究的模型（Richardson 等，2023）。其入侵性与一系列特征相关，包括快速生长和高资源利用能力（Rodríguez-Echeverría 等，2009；Werner 等，2010），大规模开花（Correia 等，2014），广谱授粉系统，持久的土壤种子库以及火灾刺激的萌发（Gibson 等，2011；Le Maitre 等，2011；Passos 等，2017）。

近年来，植物与微生物的相互作用成为研究的热点，特别是种子中的内生微生物。这一特性在入侵过程中可能发挥重要作用，因为种子中富含对植物健康和生产力至关重要的微生物（Condessa 等，2024）。在植物微生物群落的构建过程中，早期的定殖过程中的微小差异可能会导致后期生命周期中显著的微生物群落差异（Fukami，2015；Bergmann & Leveau，2022）。随着下一代测序技术的进步，我们能够深入了解微生物群落，从而更全面地认识其在入侵过程中的潜在作用（例如 Simonin 等，2022）。然而，这些方法也存在一定的局限性，而传统的微生物学方法则有助于建立微生物菌株库，这些菌株可以通过后续的功能和生态研究进行深入探索。

种子中的内生微生物可以来自水平或垂直传播，受土壤特性及环境压力的影响（Truyens 等，2013；Martiny 等，2015），这表明其功能特性对于克服非生物波动具有重要意义。此外，内生微生物能够迅速改变其功能特性，并通过与植物的共生关系将这种适应性传递给植物（Compant 等，2010；Doty，2017）。同时，植物会根据自身需求选择性地采纳不同的内生微生物（Garbeva 等，2004；Wang & Zhang，2023）。每一代植物都会将种子内生微生物群落传递给下一代，使其得以保存和再利用（Johnston-Monje 等，2014），同时维持有利的功能特性并淘汰不再有用的微生物（Martiny 等，2015）。尽管有证据表明种子内生微生物对入侵性特征具有积极作用（Molina-Montenegro 等，2023），但其在入侵过程中的潜在作用尚未被充分探索（Gioria 等，2023）。在入侵 Acacia 中，种子特性被认定为影响入侵性的重要因素，尤其是其能够形成持久种子库的能力，这有助于在时间和空间上增强其殖民和扩散（Le Maitre 等，2011）。然而，种子内生微生物的作用仍缺乏系统研究，进一步了解其在入侵植物行为中的作用可以为全球范围内的入侵植物研究提供新的视角。

在此背景下，本研究的主要目标是确定入侵植物种子中可培养的内生微生物群落是否从周围环境中获得，从而提供竞争优势。为此，我们分析了葡萄牙西部两种地中海生境中，入侵与本地共存的Fabaceae植物种子中的可培养内生微生物组成。具体而言，我们旨在（1）评估同一生境中本地与入侵植物种子内生微生物群落的差异，以及（2）探讨这些可培养内生微生物的潜在功能。通过比较不同植物种类在种子中携带的微生物种类，我们期望揭示这些微生物在植物入侵成功中的作用。

研究选择了两种被 Acacia spp. 侵入的自然生境：沿海沙丘和混合橡树与松林林地。为了确保种子采集的代表性，我们选择了在相同生境中生长的本地和入侵植物，并在种子扩散高峰期进行采集。沿海沙丘（Dune）和林地（Forest）的研究地点分别位于 Península de Setúbal 的 Mata dos Medos 和 Tróia，以及 Serra de Sintra。这些地区具有地中海气候，夏季炎热干燥，最热月份（八月）和最冷月份（一月）的平均月温度分别为 23.2°C 和 10.1°C（Dune），以及 19.6°C 和 10.4°C（Forest）。年平均降水量在 Dune 为 736 mm，在 Forest 为 884 mm（数据来源：最近的气象站；Domingos，2008；IPMA，2024）。

在 Dune 生境中，旱生灌木群落是主要植被类型，常出现在开放松林或桉树林的下层。主要的灌木包括 Stauracanthus genistoides、Halimium calycinum、Juniperus turbinata 亚种 turbinata 和 Corema album。土壤主要由更新世至中新世的沙质和砂岩沉积物构成（Costa 等，1998）。Serra de Sintra 地区则拥有丰富的地中海和大西洋起源的植物群落，其研究区域是松树（Pinus pinaster）、桉树（Eucalyptus globulus）和栓皮栎（Quercus suber）混合森林，其下层植被包括毒刺（gorse）和灌木群落。主要的灌木包括 Arbutus unedo、Calluna vulgaris、Erica arborea、Cistus salviifolius、Genista triacanthos、Q. lusitanica 和 Ulex jussiaei。该山脉由晚白垩纪 Sintra 岩浆复合体形成，这些岩浆侵入了中生代的沉积岩地层。由于差异侵蚀，花岗岩正长岩、辉长岩和二长岩在沉积岩地层上占据主导地位（Kullberg & Kullberg，2020）。该地区的土壤类型以岩石土壤（lithosols）为主。

在每个生境中，我们选择了在夏季早期结实的本地Fabaceae植物物种。Acacia spp. 已被引入葡萄牙并被列为入侵植物（Decreto-Lei no. 92/2019，葡萄牙环境部，2019）。在本研究中，这些物种根据其高丰度和入侵性进行选择。所研究的植物及其特征详见表 1。Acacia spp. 在 Dune 和 Forest 生境中均有分布；然而，在 Dune 生境中，Acacia 的灌木群落较为分散，而在 Forest 生境中，Acacia 通常形成密集的树群。这些 Acacia spp. 根据葡萄牙法律被列为入侵植物（Decreto-Lei no. 565/99，葡萄牙环境部，1999），并且是其中最具破坏性的植物之一。Acacia melanoxylon 和 Acacia saligna 分别被分类为具有重大和中等影响的入侵植物（Kumschick & Jansen，2023）。

为了研究种子内生微生物群落，我们从每个植物物种中采集了 10 到 40 棵成熟植株的种子（具体数量取决于种子的可用性），并在 2021 年 6 月的种子扩散期间进行采样。采集许可由国家自然保护局（Instituto da Conserva??o da Natureza e das Florestas，许可编号 947-2021-REC 和 948-2021-REC）批准。植物材料被送至实验室，并通过筛子去除种子和其它杂质。受损或受感染的种子被丢弃。所有可能的种子在纸袋中以室温储存，直至使用。每个物种随机选取 20 颗种子进行称重，以确定平均种子重量。

种子的表面消毒和萌发过程包括依次浸泡在 70% 乙醇中 1 分钟、5% 次氯酸钠（商业漂白剂）中 6 分钟，随后进行五次无菌蒸馏水冲洗，最后转移至煮沸的无菌蒸馏水中。使用无菌手术刀对种子进行个体划痕处理以促进萌发。种子在 1% 的琼脂上萌发，置于室温下黑暗培养 2 天，之后转移至 28°C 持续光照的培养箱中培养 1 到 2 周，直至种子萌发（即胚根出现）。如果在培养过程中出现真菌或细菌生长，则丢弃培养皿。

通过使用研钵和研杵将每个植物物种的约 3 克萌发种子与 1 mL 蒸馏水混合，并接种于酵母甘露醇琼脂（YMA）和马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）平板上，以分离细菌和真菌。对每个植物物种进行新的分离，直到不再获得新的形态学上不同的菌落。分离和纯化后，无菌培养物进行宏观观察和特征分析。对于细菌，我们进行了常规的 KOH、过氧化氢酶和氧化酶测试（Condessa 等，2024）。此外，我们还制备了革兰氏染色载玻片，用于光学显微镜观察。形态学和生化特征与分子指纹图谱一起用于聚类分析。

DNA 提取遵循改良的 GES 协议（胍基异硫氰酸盐、EDTA 和 Sarkosyl；Pitcher 等，1989），其中增加了更高的温度（60°C 而非原始协议中的 37°C）和一次冷乙醇洗涤步骤。每个纯菌落的菌落被用作起始材料，最终的重悬液为 50 μL 的 TE 缓冲液（Tris-EDTA）。所有分离株的 DNA 都通过聚合酶链反应（PCR）进行扩增，使用通用引物 csM13（5′-GAGGGTGGCGGTTCT-3′）、(GTG)5（5′-GTGGTGGTGGTGGTG-3′）和 PH（5′-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′）。这些引物不具特异性，常用于不同物种的 DNA 扩增，以便进行指纹图谱分析。这涉及对 DNA 图谱的比较，是微生物菌株初步研究的常见方法。PCR 混合液包括 1 U Taq DNA 聚合酶（NZYTaq II，Nzytech）、3 mM MgCl2、1× 反应缓冲液、0.2 mM 每种 dNTPs、0.2 pmol/μL 引物和 2 μL 模板 DNA，总体积为 25 μL。PCR 在 BioRad T100 热循环仪上进行，初始循环为 5 分钟 95°C，随后进行 40 次循环：1 分钟 95°C、2 分钟 50°C、2 分钟 72°C，最后进行 5 分钟 72°C 的延伸。对每个植物物种获得的所有分离株进行了 10% 的随机复制。扩增的 PCR 产物通过电泳分离，时间为 5 小时，电压为 85 V，电泳凝胶为 1%（w/v）琼脂糖凝胶，缓冲液为 0.5× TBE 缓冲液。凝胶用 0.5 ng/μL 的溴化乙锭染色 10 分钟，通过紫外灯在转光器上可视化，并使用 Alliance 4.7 软件（Uvitec，剑桥，英国）和其相关软件 Alliance v. 15.15 进行处理。

通过比较每个分离株的 DNA 图谱，使用 BioNumerics 软件（Applied Maths N.V.，1998）进行聚类分析，基于皮尔逊相关系数和非加权平均聚类（UPGMA）算法。同样，基于三个引物的复合聚类分析也被执行。10% 的随机复制图谱有助于确定树状图的截断点（图 S1 和 S2）。

通过 16S rRNA 和 ITS rRNA 序列分析对细菌和真菌内生微生物进行分类鉴定。对于 16S rRNA，使用引物组合 PA(8f)（5′–AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和 907r（5-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3），而 ITS 的引物对为 ITS5（5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′）和 ITS4（5′TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）。所有在指纹图谱分析后获得的簇代表性的分离株均被纳入分析。PCR 混合液与之前使用的方法相似，但使用了 2 mM MgCl2。PCR 程序始于 3 分钟 94°C 的初始循环，随后进行 35 次循环：1 分钟 94°C、1 分钟 55°C、1 分钟 72°C，最后进行 3 分钟 72°C 的延伸。所有 PCR 产物按照 STABVIDA 的常规程序进行纯化，并使用 STAB VIDA（葡萄牙，Costa da Caparica）进行测序。

DNA 序列通过 Geneious 软件（v. 5.3，2010，https://www.geneious.com）进行编辑和分析。所有序列与 GenBank 中的数据进行比对，分别使用 BLAST 进行细菌和真菌的 16S rRNA 和 ITS 数据库分析。通过指纹图谱获得的簇分析有助于识别同一簇内的分离株。所有 DNA 序列均提交至 GenBank（访问号 PP703184–PP703237 用于细菌；PP704364–PP704397 用于真菌；详见表 S1 和 S2）。

为了探索不同植物种子中可培养微生物群落的差异，我们使用主坐标分析（PCoA）和非度量多维尺度分析（NMDS）对微生物群落进行分析，基于 Bray–Curtis 相似度矩阵构建距离矩阵，包括所有鉴定的 Operational Taxonomic Units（OTUs）。此外，我们还对每个生境中植物内生微生物群落进行聚类分析，以探讨它们之间的关系。在每个植物物种中，我们通过累积相对丰度绘制了内生微生物群落，并排除了未鉴定的分离株。未鉴定的菌株在测序值低于 90% 或仅能在属水平进行鉴定时被考虑。

使用 BioNumerics 软件构建了比较不同植物物种内生微生物群落的树状图。我们计算了 Shannon-Weiner（H′）和 Chao1 指数，以确定每个植物物种中可培养微生物的多样性和丰富度（Krebs，1989）。所有鉴定的 OTUs 均用于功能预测，基于 FAPROTAX v. 1.2.6（Louca 等，2016）和 FungalTraits（P?lme 等，2020）数据库，分别用于细菌和真菌的功能预测。我们构建了基于这些数据库的出现和缺失矩阵，并计算了每个鉴定功能在各植物物种中的累积相对丰度。各 OTU 的预测功能详见表 S3 和 S4。

数据的分析使用了 R 软件包 stats、rstatix 和 microeco（R Core Team，2022，版本 4.2.2）。

在本研究中，Fabaceae 种子的质量在不同物种之间存在差异，从 Genista triacanthos 的 0.05 ± 0.02 克到 Erophaca baetica 的 3.58 ± 0.09 克。在 Dune 生境中，E. baetica 的种子质量最高，而 Stauracanthus genistoides 的种子质量最低（0.12 ± 0.02 克）。在 Forest 生境中，A. melanoxylon 的种子质量最高（0.72 ± 0.08 克），而 G. triacanthos 的种子质量最低（0.05 ± 0.02 克）。总体而言，Dune 生境中的种子质量高于 Forest 生境。

通过比较不同植物物种种子中可培养的内生微生物群落，我们发现 Acacia 与本地物种在生境内的内生微生物群落组成相似，而在考虑宿主状态（入侵 vs. 本地）时，微生物群落的差异更为明显。尽管传统的微生物培养方法存在一定的偏倚，因为可培养微生物仅占整个微生物群落的一小部分（例如 Sondo 等，2023），但我们在两种生境中均发现入侵植物种子的微生物群落比本地植物种子具有更高的多样性和丰富度。这表明，入侵植物种子中可培养的微生物群落具有更广泛的潜在功能，可能有助于提高其多功能性。由于许多微生物在本地植物中也存在，这可能意味着 Acacia 可以通过与本地微生物建立共生关系来增强其入侵能力。然而，进一步的研究仍需澄清这些微生物在生态系统中的生态意义及其对入侵成功的影响。此外，Dune 和 Forest 生境中的植物可能在微生物内生群落的构建上存在差异：前者更依赖于环境筛选，而后者则更依赖于宿主选择（Bergmann & Leveau，2022；Jesus 等，2025）。

我们的研究发现，Acacia 种子中的微生物群落比本地 Fabaceae 植物更为丰富和多样化。许多这些微生物在本地植物中也存在，表明 Acacia 可能通过与本地微生物建立联系来增强其入侵能力。尽管这些微生物的生态功能尚未完全阐明，但它们的存在可能反映了 Acacia 的适应性和机会主义行为，这有助于其在新环境中成功建立和扩散。在 Dune 生境中，Acacia 和本地植物的内生微生物群落相似性更高，而在 Forest 生境中，这种相似性较低，表明宿主和环境筛选在不同生境中的相对影响有所不同。虽然种子内生微生物只是影响入侵动态的多个因素之一，但进一步的研究应探讨其生态功能，包括比较同属入侵与非入侵植物的种子内生微生物群落。

植物与微生物的广谱共生关系被认为是促进入侵成功的重要因素（Lau & Funk，2023）。然而，由于入侵过程具有高度的环境依赖性，不同环境可能涉及不同的特征和因素，因此需要在更广泛的地理尺度上研究种子内生微生物群落的作用。此外，考虑到许多 Acacia spp. 的种子萌发受到火灾的刺激，导致种群增长和常常形成单一物种的群落，同时火灾对土壤微生物群落具有负面影响，因此在火灾后环境中研究种子内生微生物群落具有重要意义。