通过单细胞转录组学揭示小麦根系对盐胁迫的细胞类型特异性和品种特异性响应

《Plant Biotechnology Journal》：Cell-Type-Specific and Variety-Specific Responses to Salt Stress in Wheat Root Revealed by Single-Cell Transcriptomics

小麦盐胁迫单细胞转录组图谱揭示根毛细胞特异性响应及耐盐机制。通过snRNA-seq分析盐敏感（CS）和耐盐（DK）品种的根部单细胞转录组，鉴定出17种细胞类型，发现根毛细胞对盐胁迫响应最显著。比较分析表明，DK品种通过代谢重编程和细胞修复机制增强耐盐性，并首次验证TaGSTU1-5B基因通过清除活性氧增强耐盐性。研究还揭示了亚基因组非对称表达模式与耐盐性的关联。

　　土壤盐碱化是威胁全球农业生产力的关键非生物胁迫之一。它不仅影响作物的生长、发育和产量，还会损害土壤健康，破坏生态平衡。目前，世界上约20%的可耕地受到盐碱化的困扰，每年造成的经济损失超过270亿美元。随着气候变化、不合理的灌溉方式和不可持续的耕作方法的持续影响，预计到2050年，超过50%的可耕地将面临盐碱化问题。因此，解析作物在盐碱胁迫下的分子机制，对于培育高抗盐品种至关重要，这为应对盐碱化和人口增长带来的挑战提供了希望。

为了应对这一问题，先进的基因组技术成为不可或缺的工具。单核RNA测序（snRNA-seq）是一种突破性的高通量技术，能够以单细胞分辨率对细胞转录组进行测序，揭示细胞异质性、获取细胞类型信号、构建细胞图谱，并阐明器官中各种细胞类型的特点和状态。因此，snRNA-seq已被广泛应用于生物学和医学研究，推动了对细胞多样性、细胞间通信、等位基因表达以及细胞发育轨迹的理解。在植物系统中，snRNA-seq最初应用于拟南芥（Shulse et al. 2019），随后扩展到多种物种和组织，包括水稻根部（Liu et al. 2021）、玉米发育穗（Xu et al. 2021）、杨树茎分化木质部（Xie et al. 2022）、番茄顶端生长点（Tian et al. 2020）、棉花色素腺（Sun et al. 2023）以及小麦根部（Zhang, Li, et al. 2023; Du, Zhang, et al. 2025）。这些研究突显了snRNA-seq在解析植物响应各种环境胁迫机制中的广泛应用和有效性。尽管已有这些进展，但在主要作物如小麦中的单细胞水平胁迫响应研究仍较为稀缺。

本研究首次对盐敏感（CS）和盐耐受（DK）小麦品种在盐胁迫下的根尖细胞进行了snRNA-seq分析，以揭示其转录组景观。随后，我们系统地调查了多样化的细胞簇、表达模式和调控网络，以识别关键的功能候选基因。值得注意的是，通过对候选基因TaGSTU1-5B的过表达进行功能验证，确认了其在提高小麦盐胁迫耐受性中的积极作用。本研究标志着小麦在盐胁迫下首次进行单核转录组研究，提供了关于这种全球重要作物盐响应分子和细胞机制的新见解。我们的发现为未来在功能基因组学和培育盐适应性小麦品种方面的研究奠定了基础。

在本研究中，我们构建了盐敏感和盐耐受小麦品种在盐胁迫下的单细胞转录组图谱。我们通过分析盐敏感品种中国春（CS）和盐耐受品种德康961（DK）在0小时、3小时和8小时盐胁迫条件下的根尖细胞，获得了201,273个单核转录组数据，覆盖了12个数据集，平均每个样本包含16,773个核。我们排除了双细胞、低质量核（线粒体基因含量>5%）以及酶消化受损细胞，最终获得了188,270个高置信度的核，每个核平均检测到4766个基因（图S1E–K和表S1）。这些结果不仅验证了snRNA-seq数据的可靠性，还为解析小麦盐胁迫耐受性的保守和品种特异性调控机制提供了宝贵的资源和视角。

为了进一步验证snRNA-seq数据的可靠性，我们进行了与批量RNA-seq数据的交叉验证。匹配样本之间的皮尔逊相关系数（PCCs）范围在0.76到0.84之间（图S2A），表明数据之间有很强的一致性，从而确认了整体的可靠性。此外，snRNA-seq数据集的样本间相关性分析表明，处理匹配的样本显示出比两个品种之间的样本更高的转录相似性（图S2B和S3A,B），这暗示品种的遗传背景可能对基因表达的影响大于盐胁迫处理本身，反映出品种特异性特征和耐盐机制的多样性。

为了解决多样本snRNA-seq工作流程中固有的技术批次效应（图S3C,D），我们采用典型相关分析（CCA）和统一流形逼近与投影（UMAP）嵌入方法进行数据整合（图1B,C和S4A,B）。这一分析划分出24个簇，共同代表了正常和盐胁迫条件下小麦根尖细胞的细胞景观。我们还识别并可视化了簇特异性标记基因，这些基因表现出高度受限的表达模式（图1D和S4C），进一步验证了我们聚类结果的稳健性。

为了进一步确认细胞类型注释的生物学相关性，我们对每个簇的簇特异性上调差异表达基因（up-DEGs）进行了基因本体（GO）富集分析（表S3和S4）。每个簇的前15个显著富集的生物过程（BPs）与它们注释的细胞类型生理角色高度一致。例如，簇0和17被鉴定为近端分生组织，显著富集了姐妹染色单体分离（GO:0000819；FDR: 1.08e-07）、染色体组织（GO:0051276；FDR: 7.98e-03）、DNA拓扑变化（GO:0006265；FDR: 8.49e-05）以及核糖体生物发生（GO:0042254；FDR: 1.71e-05），这些与它们在活跃细胞生长和分裂中的作用相符。同样，簇4被注释为根毛细胞，显著富集了根毛伸长（GO:0048767；FDR: 1.41e-05）和根发育调控（GO:2000280；FDR: 2.68e-05）。簇9和11被鉴定为木栓形成层细胞，表现出与生长素稳态和生长素外排相关的显著富集术语，反映了它们在木质素沉积中的作用。这些结果共同支持了我们细胞类型注释的可靠性（图S8A,B）。

这些结果确认了我们细胞类型注释的稳健性，并描绘了盐胁迫下不同细胞谱系的转录重编程，突出了细胞类型特异性对渗透挑战的适应性反应（图1）。

为了研究CS和DK在单细胞分辨率下的保守和品种特异性细胞类型对盐胁迫的响应，我们比较了控制（0小时）和盐胁迫条件（3小时、8小时）下细胞类型比例的变化（图2A、S9A–C和表S5）。两种品种均表现出一些共同的响应，包括根毛和分生组织2细胞群的显著减少（Student's t-测试，p<0.05）以及原生质体和未成熟中柱鞘细胞群的扩张（Student's t-测试，p<0.05）（图S9A–C、S10A和S11A），这表明存在一种保守的响应机制。值得注意的是，DK在盐适应过程中表现出独特的动态变化，从3小时到8小时，其表皮/皮层和根毛细胞比例逐渐下降，而内皮层、前血管和筛管细胞群的比例显著上升（Student's t-测试，p<0.05）。这些变化可能反映了DK在盐胁迫下对根结构和功能的调整，以增强其耐盐性和适应性，而这些调整在CS中并未观察到（图S12A和S13A）。这些品种特异性变化可能涉及DK的增强耐盐性。

此外，我们还对盐响应上调差异表达基因（up-DEGs）进行了功能注释，通过GO和KEGG分析（图2D和S14D；表S7和S8）揭示了CS和DK在盐胁迫下的共同富集生物过程（top 25），包括响应水分剥夺（GO:0009414）、毒素分解过程（GO:0009407）以及低氧检测（GO:0001666）（Li et al. 2024）。值得注意的是，DK在响应胁迫（GO:0006950）和响应非生物刺激（GO:0009628）方面表现出显著的富集，这些与盐胁迫耐受性密切相关。此外，还观察到了一种独特的激活模式，即戊糖磷酸途径（ko00030），该途径已被报道在植物盐胁迫耐受机制中起关键作用。这些发现突出了根毛在植物盐胁迫响应和耐受中的关键作用。

HKT基因家族是已知的盐响应和耐受调节因子（Wang et al. 2024；Gholizadeh et al. 2024；Hua et al. 2024）。我们进一步系统地评估了小麦HKT基因家族在细胞类型和处理条件下的表达活性（图2E）。具体而言，显著的盐诱导HKT表达变化仅在CS和DK的根毛细胞中观察到（Student's t-测试，p<0.0001），其中TaHKT1-D（TraesCS2D02G428200）在根毛细胞中表现出细胞类型特异性高表达（图2F）。这些发现与之前的研究结果一致，强烈支持根毛细胞在小麦根部盐胁迫响应中的最关键作用。这种细胞类型特异性响应/适应机制可能在小麦耐受盐碱环境方面发挥核心作用，为未来增强作物耐盐性的遗传改良策略提供重要见解。

除了细胞层面，我们还进一步研究了盐胁迫响应基因在根毛中的基因层面差异表达模式。我们首先识别了在三种不同的盐胁迫条件下（初始盐胁迫：0小时 vs. 3小时，适应盐胁迫：3小时 vs. 8小时，长期盐胁迫：0小时 vs. 8小时）每个细胞类型中的差异表达基因（DEGs）。根毛细胞在所有细胞类型中表现出最多的DEGs（图S15A和表S9），确认了其在盐胁迫响应中的关键作用。进一步分析DEG分布（图3A,B和S16A,B）显示，两种品种在初始盐胁迫阶段表现出比适应阶段更多的up-DEGs。这一模式反映了根毛细胞在面对突然盐胁迫时表现出显著的细胞异质性和快速应急响应机制，而在适应过程中其基因表达趋于稳定。有趣的是，尽管CS和DK在长期盐胁迫下的up-DEGs数量相似（CS: 1014，DK: 1000），但DK在初始盐胁迫阶段表现出更多的up-DEGs，这表明DK可能具有更高效的基因表达调控机制来应对盐胁迫，这可能有助于其更高的耐盐性。

此外，我们对盐响应up-DEGs进行了功能表征，通过GO和KEGG分析（图3D和S14D；表S7和S8）揭示了两种品种在盐胁迫下共享的富集生物过程（top 25），包括响应水分剥夺（GO:0009414）、毒素分解过程（GO:0009407）以及低氧检测（GO:0001666）（Li et al. 2024）。值得注意的是，DK在响应胁迫（GO:0006950）和响应非生物刺激（GO:0009628）方面表现出显著的富集，这些与盐胁迫耐受性密切相关。此外，长期盐胁迫下，戊糖磷酸途径（ko00030）的激活也显示出与盐胁迫耐受性相关，这进一步强调了根毛在植物盐胁迫响应和耐受中的关键作用。

我们的研究还揭示了盐胁迫下小麦根部基因表达的非对称调控模式。通过分析bulk RNA-seq数据，我们发现大约33.49%的基因三联体（A、B和D基因组上的基因拷贝）表现出非对称表达模式，这与之前的研究结果一致（Ramírez-González et al. 2018）（图6A和表S12）。此外，我们解析了CS和DK根部的非对称基因表达，并发现17种细胞类型中，非对称表达模式的基因比例在45.4%到53.3%之间（图6B、S22A–F和S23A；表S13）。这些结果强烈支持了非对称基因表达水平在不同发育阶段和细胞类型中高度异质性的观点。值得注意的是，包括茎细胞龛（SCN）、根边细胞和伴细胞在内的特定细胞类型，在CS和DK中表现出最高的非对称表达模式基因比例（图6B–D）。

有趣的是，我们的分析还揭示了一个以前未被报道的现象：长期盐胁迫暴露逐渐提高了CS和DK中基因三联体的非对称表达比例，这一趋势在bulk RNA-seq和snRNA-seq数据集中得到了一致验证（图6A–D）。值得注意的是，DK表现出比CS更强的非对称表达比例增加，这暗示了亚基因组转录不对称性可能作为盐适应的调控机制，这可能是DK更高耐盐性的基础。为了进一步解析这一关联，我们系统地量化了根毛细胞中响应盐胁迫的基因集合在五种表达模式中的分布。其中，up_1、up_2和up_3的表达水平随盐胁迫时间增加而上升，up_1与生长调控相关，up_2与抗氧化防御相关，up_3与营养积累相关。这些模式在CS中更为显著，表明CS依赖于增强的能量代谢、胁迫信号传导和渗透调节来应对盐胁迫。然而，DK中突出的up_4和up_5模式，富含碳水化合物代谢（up_4）、能量代谢、胁迫响应和细胞修复（up_5）（图3H），突出了其通过细胞内活动和细胞修复来应对盐胁迫的策略。下调表达模式与信号传导、离子信号传导和有机物质运输相关（图3I），而其他模式（如other_4和other_5）则反映了随着盐胁迫时间的延长，细胞防御和稳态的稳定化（图3J）。

这些发现表明，盐敏感品种CS优先考虑快速胁迫信号传导和渗透调节，而盐耐受品种DK则强调代谢适应和细胞修复。这种遗传和功能上的差异为解析盐胁迫响应在基因层面的动态和基因型变化提供了宝贵的见解。

我们研究的一个关键创新是使用伪时间轨迹分析（图4）来识别DK特异的适应机制。我们发现了TaGSTU1-5B基因，该基因参与谷胱甘肽代谢，作为盐耐受的候选调节因子。通过过表达验证，确认了其在提高小麦盐胁迫耐受性中的作用，这为小麦改良提供了一个有前景的目标——这是首次在单细胞分辨率下展示这一结果（图5）。

此外，我们揭示了六倍体小麦在盐胁迫下新的亚基因组表达调控模式。我们分析了bulk RNA-seq和snRNA-seq数据中A、B和D亚基因组的同源基因三联体。每个亚基因组的蛋白质序列通过BLASTP（相似度阈值>90%）进行比对，确定了三个最相似的同源基因，从而得到了17,894个高置信度的同源基因三联体用于后续分析。根据Ramírez-González等（2018）提出的分类标准，所有基因被分为七类：A主导、B主导、D主导、A抑制、B抑制、D抑制和平衡。对于bulk RNA-seq数据，我们对生物重复的FPKM（每百万映射片段中每千碱基外显子模型的片段数）值进行了平均。每个三联体内的表达水平被标准化，使得三个同源基因的表达值总和为1。我们计算了所有处理组（“CS_0h”，“CS_3h”，“CS_8h”，“DK_0h”，“DK_3h”，和“DK_8h”）中每类基因的比例，并使用ggtern包生成了三元图，以可视化亚基因组表达偏倚在细胞环境中的分布。

对于snRNA-seq数据，我们使用AverageExpression函数提取了所有细胞类型在六个处理组中的表达矩阵。相同的标准化程序被应用以确保三联体的总表达为1。每个细胞类型中各类基因的比例被计算，并使用ggtern包生成了三元图，以可视化亚基因组表达偏倚在细胞环境中的分布。

为了进一步阐明盐胁迫响应的机制，我们对从平衡状态（0小时）过渡到A主导（图6G）、B主导（图6H）和D主导（图6I）状态的基因集合进行了富集分析。转换为D主导的基因在CS和DK中均富集于根冠发育和纵向轴特化相关功能，这与之前报道的D主导基因与根发育密切相关（Zhang, He, et al. 2023；Wang et al. 2018）。同时，与盐胁迫响应相关的功能，如响应非生物刺激、铁离子运输和细胞内pH调节，也被富集，这表明D主导基因不仅在促进根生长中起关键作用，还通过调节离子稳态和细胞内环境来增强盐胁迫耐受性。同样，转换为A主导的基因显著富集于离子运输、盐胁迫响应的正向调控、防御响应的负向调控以及生长素响应，这表明这些基因通过维持离子平衡和生长素信号调节来促进盐胁迫耐受性。相比之下，转换为B主导的基因没有与盐胁迫相关功能显著关联，这表明这些基因可能不是小麦盐胁迫响应的关键驱动因素（图6G–I和S24B–G）。

这些发现表明，盐耐受性小麦品种（DK）通过增强盐胁迫响应基因在主导亚基因组中的表达不对称性建立了更高效的适应调控机制。值得注意的是，A和D主导的亚基因组似乎在盐胁迫期间表现出更强的转录响应，这表明它们可能在盐胁迫耐受机制中起重要作用。这些观察结果突显了亚基因组特异性调控活动与增强胁迫耐受性的潜在联系，为未来研究小麦适应盐碱环境的分子基础提供了参考框架。

本研究的另一个重要发现是，盐胁迫下根毛细胞表现出最强的转录响应（图2B–D），这与之前在拟南芥和非-heading Chinese cabbage中的根毛在早期胁迫感知中的作用一致（Liu, Kang, et al. 2025；Wang et al. 2008；Wang and Li 2008）。这表明根毛细胞在小麦根部对盐胁迫的响应中扮演着关键角色。

通过GO和KEGG分析，我们进一步揭示了根毛细胞在盐胁迫下的不同时间点和基因型响应策略（图3C–F）。尽管两种品种共享核心的盐胁迫响应通路，但它们表现出不同的功能偏好：CS强调快速胁迫信号传导和渗透调节，而DK则偏向代谢重编程和细胞修复（图3G–I）。这些发现表明，DK的增强盐胁迫耐受性可能源于其在细胞层面的更适应性和持续性响应策略。

我们的研究还揭示了盐胁迫下亚基因组表达的不对称调控模式。通过分析bulk RNA-seq和snRNA-seq数据中的同源基因三联体，我们发现盐胁迫下A、B和D亚基因组的基因表达模式存在显著差异。这种差异在盐胁迫的各个阶段和细胞类型中表现出高度的异质性。值得注意的是，DK在盐胁迫下表现出比CS更强的亚基因组表达不对称性，这可能与其更高的耐盐性有关。

此外，我们对盐胁迫下不同细胞类型中的基因表达模式进行了富集分析。在盐胁迫的各个阶段，A和D主导的基因表现出更高的表达比例，这与盐胁迫耐受性的增强直接相关。这些结果进一步强调了亚基因组调控在小麦盐胁迫适应中的重要作用。

本研究的创新性在于使用伪时间轨迹分析（图4）来识别DK特异的适应机制。我们发现了TaGSTU1-5B基因，该基因参与谷胱甘肽代谢，作为盐胁迫耐受性的候选调节因子。通过过表达验证，确认了其在提高小麦盐胁迫耐受性中的作用，这为小麦改良提供了一个有前景的目标。这一发现不仅表明TaGSTU1-5B在盐胁迫下的抗氧化防御机制中的潜在作用，还进一步突显了该基因在环境胁迫分子响应中的重要性。

为了进一步阐明盐胁迫响应的机制，我们对从平衡状态（0小时）过渡到A主导（图6G）、B主导（图6H）和D主导（图6I）状态的基因集合进行了富集分析。转换为D主导的基因在CS和DK中均富集于根冠发育和纵向轴特化相关功能，这与之前报道的D主导基因与根发育密切相关（Zhang, He, et al. 2023；Wang et al. 2018）。同时，与盐胁迫响应相关的功能，如响应非生物刺激、铁离子运输和细胞内pH调节，也被富集，这表明D主导基因不仅在促进根生长中起关键作用，还通过调节离子稳态和细胞内环境来增强盐胁迫耐受性。同样，转换为A主导的基因显著富集于离子运输、盐胁迫响应的正向调控、防御响应的负向调控以及生长素响应，这表明这些基因通过维持离子平衡和生长素信号调节来促进盐胁迫耐受性。相比之下，转换为B主导的基因没有与盐胁迫相关功能显著关联，这表明这些基因可能不是小麦盐胁迫响应的关键驱动因素（图6G–I和S24B–G）。

这些发现表明，盐耐受性小麦品种（DK）通过增强盐胁迫响应基因在主导亚基因组中的表达不对称性建立了更高效的适应调控机制。值得注意的是，A和D主导的亚基因组似乎在盐胁迫期间表现出更强的转录响应，这表明它们可能在盐胁迫耐受机制中起重要作用。这些观察结果突显了亚基因组特异性调控活动与增强胁迫耐受性的潜在联系，为未来研究小麦适应盐碱环境的分子基础提供了参考框架。

此外，我们还揭示了盐胁迫下六倍体小麦中新的亚基因组表达调控模式。通过结合bulk RNA-seq和snRNA-seq分析（图6A–D），我们发现长期盐胁迫逐渐放大了CS和DK中基因非对称表达的比例——这是一个尚未报道的新发现。对从平衡状态过渡到A主导（图6G）、B主导（图6H）和D主导（图6I）状态的基因集合的富集分析显示，A或D主导基因的上调与增强盐耐受性相关，这进一步强调了亚基因组调控在小麦盐适应中的作用。

需要注意的是，在受控实验室条件下进行的均匀盐胁迫可能无法完全捕捉盐碱与其他环境因素之间的复杂相互作用（Ryu et al. 2019）。我们选择了代表性的盐敏感和盐耐受小麦品种，以识别盐耐受的细胞类型特异性和品种特异性机制，这确保了我们研究结果的可比性和相关性。此外，用于盐胁迫处理的固定时间点可能遗漏早期或恢复期的动态转录变化；盐胁迫效应通常需要时间累积（Julkowska and Testerink 2015），这使得细胞和基因层面的异质性更加明显（Munns and Tester 2008；Shavrukov 2013）。因此，所选的0小时、3小时和8小时时间点有效地反映了盐胁迫响应在特定时间段内的变化，并为未来动态分析奠定了基础。

本研究不仅揭示了小麦根部对盐胁迫的细胞类型特异性响应机制，还通过基因表达分析和功能验证，发现了关键基因TaGSTU1-5B在提高盐耐受性中的作用。这些发现不仅为理解小麦盐胁迫适应性提供了新的视角，还为未来培育耐盐小麦品种提供了重要的分子靶点。同时，研究还揭示了盐胁迫下亚基因组表达的不对称性，为解析多倍体植物的基因调控机制提供了新的思路。这些结果有助于推动农业可持续发展，特别是在盐碱化日益严重的背景下，为提升作物的环境适应性提供了科学依据。