EB1与EB3蛋白液液相分离特性的差异及其对微管功能的调控意义

《Journal of Biological Chemistry》：Distinct liquid-liquid phase separation properties of end-binding proteins EB1 and EB3

本研究针对微管末端结合蛋白EB1和EB3虽序列高度相似但液液相分离（LLPS）特性未知的问题，系统比较了二者在体外和细胞内的LLPS倾向性、凝聚体质地特性及其招募微管蛋白和成核微管聚合的能力。研究发现EB3具有更强的LLPS倾向性，其形成的液滴更粘稠，并能更有效地招募微管蛋白和促进微管聚合，尤其是在与+TIP相关蛋白CLIP-170共凝聚时，EB3/CLIP-170*液滴在极低微管蛋白浓度下即可高效成核微管。该研究揭示了EB蛋白依赖的+TIP体类型可能存在功能分化，为理解微管功能特异性调控提供了新机制。

　　

在细胞这个繁忙的都市中，微管（microtubules）如同纵横交错的交通要道，负责细胞内物质运输、维持细胞形态和分裂等重要生命活动。这些动态的蛋白纤维由αβ-微管蛋白（tubulin）异二聚体聚合而成，其正末端（plus end）的“建设”与“拆除”过程受到一群被称为正末端追踪蛋白（microtubule-plus-end-tracking proteins, +TIPs）的精密调控。其中，末端结合蛋白（End-binding proteins, EBs）作为+TIP网络的核心成员，扮演着“项目经理”的角色，负责招募其他伙伴蛋白到微管末端，共同调控微管的动态不稳定性（dynamic instability）。

近年来，生命科学领域的一个重大发现是，许多蛋白质能够通过液液相分离（liquid-liquid phase separation, LLPS）在细胞内形成无膜包裹的液态凝聚体（condensates），这些凝聚体如同功能特异的“工作坊”，可以浓缩特定分子并高效执行生物学功能。研究发现，一些微管相关蛋白（microtubule-associated proteins, MAPs）也具有LLPS能力，并在微管成核、组织和运输中可能发挥关键作用。特别是，+TIPs在微管末端形成的凝聚体被形象地称为“+TIP体”（+TIP bodies），它们被认为是调控微管动态的核心枢纽。

哺乳动物细胞表达三种主要的EB蛋白：EB1、EB2和EB3。尽管EB1和EB3的氨基酸序列有高达67%的相似性，但它们在某些细胞功能中表现出差异，例如EB3能与特定的伙伴蛋白相互作用，而EB1则不能。先前的研究表明EB1能够发生LLPS，但关于EB3的LLPS特性，以及这两种高度相似的蛋白在相分离行为上是否存在差异，这些差异又如何影响它们调控微管的功能，仍然是一个未被探索的谜题。

为了解决这些问题，发表在《Journal of Biological Chemistry》上的这项研究对EB1和EB3的LLPS特性进行了首次系统性的直接比较。研究人员惊讶地发现，尽管序列高度同源，EB3却表现出远比EB1更强的相分离倾向。EB3形成的液滴内部蛋白浓度更高，质地更粘稠，流动性更差。更重要的是，功能研究表明，EB3液滴具有更强的招募微管蛋白的能力，并能更有效地促进微管聚合，尤其是在与另一个关键的+TIP蛋白CLIP-170共同形成凝聚体时，EB3展现出显著的优势。这些发现揭示了EB蛋白依赖的+TIP体可能具有不同的物理化学性质，从而为微管功能的特异性调控提供了全新的分子机制解释。

为了开展这项研究，作者主要运用了以下几项关键技术：首先，利用蛋白质纯化技术获得了无标签的（tag-free）EB1、EB3、CLIP-170*截短体（Δ351-1438 CLIP-170）等一系列重组蛋白，避免了标签对相分离行为的干扰。其次，通过体外浊度分析（turbidity assay）和荧光显微镜成像，系统绘制了蛋白质的相图并确定了相分离饱和浓度（C_sat）。第三，利用荧光漂白恢复（FRAP）技术定量分析了蛋白质在液滴内部的动态性和流动性。第四，采用光诱导相分离（optoDroplet）系统在活细胞（HeLa细胞）中验证了EB1和EB3相分离能力的差异。最后，结合低温电子显微镜（cryo-EM）和原子力显微镜（AFM）等技术，对由蛋白质凝聚体成核产生的微管结构进行了表征。

His标签显著影响EB1发生LLPS的倾向性

研究人员首先发现，他们无法重复出先前报道的关于EB1在无分子拥挤剂条件下于低微摩尔浓度下发生LLPS的结果。经过深入探究，他们发现这种差异源于蛋白质纯化过程中使用的His标签。实验表明，带有His标签的EB1其LLPS倾向性显著增强，而无标签的EB1则需要在聚乙二醇（PEG）等拥挤剂存在下才能发生有效的相分离。因此，本研究后续所有实验均使用去除His标签的蛋白质，以确保结果的准确性。

EB1和EB3具有不同的LLPS特性

对比研究揭示，EB3的LLPS能力明显强于EB1。EB3在更低的PEG浓度下即可形成液滴，其相分离饱和浓度也显著低于EB1。在细胞实验中，通过光激活Cry2-mCherry融合蛋白系统也证实，在表达水平相近的情况下，EB3在蓝光刺激下形成的凝聚体数量远多于EB1。此外，对液滴物理性质的分析表明，EB3液滴内部的蛋白质流动性远低于EB1液滴，且其分配系数（partition coefficient）更高，说明EB3液滴内部蛋白浓度更高，质地更粘稠。

不同蛋白结构域的残基共同导致EB1和EB3不同的LLPS行为

为了探究导致EB1和EB3LLPS差异的分子基础，研究人员构建了一系列结构域互换的嵌合蛋白。令人意外的是，单纯替换内在无序区（IDR）或C末端结构域（CTD）并不能完全重现EB3的高LLPS倾向性。只有当将EB1的N末端结构域（NTD）中第29、57和73位的氨基酸替换为EB3中对应的组氨酸（H29, H57, H73）后，嵌合蛋白的LLPS能力才大幅提升，达到与EB3相当的水平。这表明EB3更强的LLPS能力是其所有三个结构域（NTD、IDR、CTD）协同贡献的结果，其中NTD中的组氨酸残基扮演了尤为重要的角色。同时，含有这些组氨酸的嵌合蛋白所形成的液滴，其动态特性也与EB3液滴相似，进一步证实了这些残基的关键作用。

EB3凝聚体具有更高的招募微管蛋白能力并可成核微管形成

功能研究发现，EB3液滴招募微管蛋白的能力强于EB1液滴。在加入三磷酸鸟苷（GTP）后，微管蛋白能够在EB3液滴内部发生聚合，形成纤维状结构，而在EB1液滴中则观察不到此现象，EB1液滴反而会缩小。这表明EB3液滴通过浓缩微管蛋白，使其浓度超过了成核所需的临界阈值，从而有效启动了微管聚合。

EB蛋白与CLIP-170的共凝聚*

+TIP体是多组分凝聚体。研究人员发现，EB3与CLIP-170截短体（CLIP-170）在亚饱和浓度下混合时，表现出强烈的协同相分离效应，而EB1与CLIP-170的协同效应则弱得多。这表明EB3更易于与其他+TIP组分共同组装成功能性的+TIP体。

微管蛋白招募进入CLIP-170液滴及微管在其中形成*

单独的CLIP-170*液滴也能高效招募微管蛋白并成核微管聚合，甚至在0.5 μM的低微管蛋白浓度下即可观察到微管从液滴中延伸出来。通过低温电子显微镜解析，确认这些纤维是具有14条原纤维（protofilament）结构的、真正的微管。

EB3/CLIP-170共凝聚体在比EB1/CLIP-170共凝聚体低一个数量级的微管蛋白浓度下即可成核微管

最关键的功能差异体现在EB/CLIP-170共凝聚体成核微管的能力上。EB3/CLIP-170液滴在微管蛋白浓度低至0.125 μM时就能有效成核微管聚合，而EB1/CLIP-170液滴则需要将微管蛋白浓度提高至1.5 μM才能观察到明显的纤维形成。令人惊讶的是，两种共凝聚体对微管蛋白的招募能力（分配系数）并无显著差异。进一步的FRAP分析显示，EB3/CLIP-170/微管蛋白凝聚体中微管蛋白的荧光恢复半衰期更长，表明其内部环境粘度更高。研究人员推测，凝聚体内部较高的粘度可能通过影响成核反应的动力学，从而更有利于微管的成核。

本研究通过系统的比较分析，揭示了同源蛋白EB1和EB3在液液相分离特性上存在显著差异。EB3凭借其NTD中的关键组氨酸残基及其他结构域的协同作用，表现出更强的LLPS倾向性，并能形成蛋白浓度更高、粘度更大的凝聚体。这些物理化学性质的差异直接转化为功能上的分化：EB3及其与CLIP-170形成的共凝聚体具有更强的微管蛋白招募能力和微管成核效率。这些发现表明，细胞内由不同EB蛋白主导形成的+TIP体可能具有截然不同的材料特性（material properties），从而为微管动力学调控和功能特化（functional specialization）提供了新的机制维度。该研究不仅深化了对EB蛋白功能的理解，也将相分离的物理化学性质与细胞骨架的生物学功能紧密联系起来，为探索相分离在细胞组织中的普遍规律提供了重要范例。