新型细菌素PFB252的发现及其抗MRSA生物膜活性在乳品保鲜中的应用研究

《Journal of Dairy Science》：Identification and characterization of a novel bacteriocin PFB252 from Bacillus velezensis with anti-MRSA and anti-biofilm activity for dairy food preservations

本研究针对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）及其生物膜形成能力对公共卫生和食品安全的严重威胁，从海洋来源的Bacillus velezensis中成功鉴定出一种新型细菌素PFB252。通过多步纯化获得高纯度PFB252，证明其具有优异的热稳定性（100°C处理1小时活性保留67.07%）、pH耐受性（pH 2-12范围内保持活性）和酶稳定性。PFB252对MRSA表现出强效抗菌活性（MIC=14.61 μg/mL），在亚抑制浓度下可显著抑制生物膜形成（最高降低52.51%），破坏胞外多糖和蛋白质基质，下调生物膜相关基因表达。在乳品应用中，PFB252能在4天内将牛奶中MRSA从103降至<10 cfu/mL，在奶酪中7天内维持细菌数低于102 cfu/g。该研究为开发天然生物防腐剂提供了新策略，对解决MRSA污染问题具有重要意义。

　　

在当今食品安全领域，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）如同一颗定时炸弹，不仅对公共卫生构成严重威胁，更给全球乳制品行业带来巨大经济损失。这种"超级细菌"的可怕之处在于其强大的生物膜形成能力——一种由细菌群体构建的"防护堡垒"，能够显著增强对抗生素的抵抗力，使得常规治疗方法往往束手无策。更令人担忧的是，MRSA能够污染食品并在其中增殖产生耐热肠毒素，给消费者健康带来严重风险。随着抗生素滥用导致的耐药性问题日益严峻，开发新型、安全有效的抗生物膜制剂已成为当务之急。

在这一背景下，细菌素——这些由细菌产生的天然抗菌肽，因其靶向性强、不易破坏菌群平衡的特点而备受关注。然而，现有细菌素在对抗MRSA生物膜方面仍存在局限性，特别是其稳定性和抗生物膜效果亟待提升。海洋微生物作为新型抗菌物质的宝库，其独特的生存环境可能孕育出具有特殊结构和功能的细菌素，这为解决问题提供了新思路。

近日发表在《Journal of Dairy Science》上的研究报道了一种来自Bacillus velezensis的新型细菌素PFB252，该物质展现出令人瞩目的抗MRSA和抗生物膜活性。研究人员通过多步纯化策略（包括酸沉淀、TA-GF75凝胶柱色谱、Tiderose Q HP阴离子交换色谱和RP-HPLC）成功获得了高纯度的PFB252。通过综合运用Tris-Tricine-SDS-PAGE、LC-MS/MS、AlphaFold结构预测等技术，结合热稳定性、pH耐受性、酶稳定性等理化性质分析，系统表征了该细菌素的基本特性。在功能研究方面，采用微量肉汤稀释法测定最小抑菌浓度（MIC），通过结晶紫染色、CCK-8法、酚硫酸法和BCA法评估抗生物膜效果，利用RT-qPCR分析基因表达，并借助扫描电镜观察生物膜结构变化。最后，通过在牛奶和奶酪中的抗菌实验验证其实际应用价值。

菌株鉴定与细菌素纯化

研究人员从湛江滨湖公园的海水样本中分离到一株具有广谱抗菌活性的细菌FB25-2，通过16S rRNA基因序列分析和全基因组测序，鉴定为Bacillus velezensis。经过多步纯化流程，最终通过RP-HPLC获得了纯度达98%的细菌素PFB252。SDS-PAGE显示其分子量约为11 kDa，LC-MS/MS精确测定为11,267.34 Da。

理化特性与结构特征

PFB252由102个氨基酸组成，理论等电点为6.45。AlphaFold结构预测显示其具有紧凑的球状折叠结构，含8个β-链和1个短α-螺旋。静电和疏水性分析表明，蛋白质表面存在带负电荷区域和疏水残基聚集区，这可能与其抗菌机制相关。

稳定性与安全性评估

PFB252表现出卓越的环境稳定性：在100°C处理1小时后仍保留67.07%的活性；在pH 2-12范围内均能保持活性，其中pH 4-6时活性最高（82.15%）；对蛋白酶具有不同程度的抗性，对木瓜蛋白酶稳定性最高（95.20%）。溶血实验证明PFB252无溶血活性，表明其具有良好的生物安全性。

抗菌与抗生物膜活性

PFB252对MRSA的MIC为14.61 μg/mL。在亚抑制浓度（1/32×MIC和1/16×MIC）下，能显著抑制生物膜形成（分别降低36.13%和52.51%），并降低生物膜内细菌的代谢活性（分别降低27.37%和37.92%）。同时，PFB252还能有效减少胞外多糖（30.26-39.32%）和蛋白质（38.45-63.63%）等生物膜基质成分。

分子机制探讨

RT-qPCR分析显示，PFB252能下调多个生物膜相关基因的表达，包括黏附相关基因（srtA、FnbA、FnbB）、生物膜基质合成基因（icaA、icaD）、全局调控基因（sarA、rsbU）和应激反应基因（RSH、relQ、sPA）。扫描电镜观察进一步证实，PFB252处理能破坏生物膜结构，使细菌从密集聚集状态变为分散状态。

乳品应用效果

在牛奶中，PFB252在MIC浓度下4天内可将MRSA从10³ cfu/mL降至<10 cfu/mL，并维持抑制效果至12天。在奶酪中，PFB252处理能使细菌数在7天内持续低于10² cfu/g，显著优于对照组。

本研究系统阐述了新型细菌素PFB252的发现历程、特性表征及其抗MRSA生物膜机制。结果表明，PFB252通过多靶点作用方式发挥抗菌功效：既直接作用于浮游细菌，又干扰生物膜形成和发展的多个环节。在分子水平上，PFB252能下调严格反应通路相关基因（RSH）表达，影响细菌代谢状态；同时抑制胞外聚合物合成基因（icaA/icaD）和黏附相关基因（srtA、FnbA/B）表达，破坏生物膜结构完整性；还通过调控全局调节因子（sarA、rsbU）影响毒力因子表达。这种多层次的作用机制使PFB252能有效对抗MRSA的生物膜相关耐药性。

在实际应用方面，PFB252在乳制品中展示出的显著抗菌效果，结合其优异的热稳定性和pH耐受性，使其成为理想的天然生物防腐剂候选物。与传统化学防腐剂相比，PFB252具有靶向性强、不易产生耐药性、安全性高等优势。该研究不仅为控制MRSA污染提供了新解决方案，也为开发基于细菌素的食品安全干预策略奠定了重要基础。未来研究可进一步探索PFB252的作用机制细节，评估其在不同食品基质中的应用效果，并考察其与其它防腐剂的协同作用，以推动其在实际生产中的广泛应用。