RP9 p.(H137L)再获证实：基因组学与长读长测序技术破解常显性剪接因子视网膜色素变性的致病谜团

《European Journal of Human Genetics》：RP9 revisited; RP9 p.(H137L) remains a likely cause of dominant splicing factor-Retinitis Pigmentosa

本研究针对RP9基因变异是否导致常染色体显性视网膜色素变性（adRP）的长期争议，通过基因组测序、长读长纳米孔测序及大队列分析，证实RP9 p.(H137L)是adRP的致病性变异，而p.(D170G)为良性。研究解决了伪基因（RP9P）干扰的误判问题，明确了RP9作为剪接因子（U4/U6.U5 tri-snRNP）在视网膜疾病中的关键作用，为临床遗传诊断提供可靠依据。

　　

在遗传性视网膜疾病研究领域，常染色体显性视网膜色素变性（autosomal dominant Retinitis Pigmentosa, adRP）因其临床异质性和复杂的致病机制备受关注。自2001年首个剪接因子PRPF8被证实与adRP相关以来，陆续有5个剪接因子基因（PRPF31、PRPF3、PRPF4、PRPF6、SNRNP200）被报道致病。然而，2002年提出的RP9基因变异（c.410A>T; p.(H137L)）却因邻近高度同源的伪基因RP9P的存在，其致病性长期遭受质疑。二十余年来，再无其他RP9致病变异被确认，导致该基因与adRP的关联悬而未决。

为澄清这一争议，研究团队利用现代基因组学技术对原始RP9连锁家系进行再分析。通过全基因组测序、长读长纳米孔测序（Oxford Nanopore Technology, ONT）以及英国10万人基因组计划（100kGP）和大规模人群数据库（gnomAD、UK Biobank）的联合分析，他们不仅验证了p.(H137L)变异位于RP9基因而非伪基因，还发现该变异在adRP患者中显著富集（5/1962例），且所有携带者均共享一个英国创始人单倍型。相反，另一争议变异p.(D170G)在人群中出现频率过高（100kGP中22例携带者均无RP表型），结合AlphaMissense预测其致病性评分低（0.374），被重新归类为良性。

本研究的意义在于：首次通过高精度测序技术排除了伪基因干扰，确立了RP9 p.(H137L)作为adRP的致病性变异；揭示了剪接因子相关RP的等位基因特异性致病机制（非单倍体不足）；为临床遗传诊断中ACMG准则的灵活应用提供了范本——当PS4（患者队列富集）和PP1（共分离）证据充足时，即使既往分类为VUS（意义不明确变异）也可升级为“可能致病”。

关键技术方法

研究依托以下核心技术支持：

1. 1.
   全基因组与全外显子测序：对原始家系成员进行高深度测序，结合RetNet数据库过滤候选变异；
2. 2.
   长读长纳米孔测序：设计9.3 kb跨RP9-RP9P区域的扩增子，通过单倍型分型明确变异来源；
3. 3.
   大队列关联分析：整合Leeds患者队列（n=556）、100kGP（n=1406）及gnomAD（n>83万）数据，计算变异富集显著性；
4. 4.
   生物信息学预测：综合CADD、FATHMM-MKL、AlphaMissense等工具评估变异致病性。

研究结果

RP9 p.(H137L)为连锁家系中唯一致病候选变异

对原始家系两名患者（相隔14次减数分裂）的全基因组数据分析显示，在RP9连锁区域（chr7: 32,320,394-34,315,743）内，仅p.(H137L)同时满足罕见性（gnomAD频率<0.001）、高致病性预测评分（CADD>15）及与表型共分离的条件。结构变异分析未发现其他致病性拷贝数变异。

长读长测序证实p.(H137L)位于RP9基因且为创始人等位基因

通过ONT测序明确区分RP9与RP9P的序列差异，发现p.(H137L)周边存在11个单核苷酸多态性（SNP）位点与非变异等位基因截然不同，且所有携带者均共享同一单倍型，证实其为英国人群创始人变异。

患者队列分析显示p.(H137L)显著富集于adRP

在1962例RP/视杆视锥细胞营养不良（RCD）患者中，5例携带p.(H137L)，而gnomAD中该变异完全缺失（0/831,084等位基因），富集显著性p<0.00001。ACMG准则升级后，该变异从VUS重新分类为“可能致病”。

p.(D170G)被确认为良性变异

尽管早期研究提示p.(D170G)可能影响RP9磷酸化及剪接功能，但100kGP中22例携带者均无RP表型，gnomAD和UK Biobank中等位基因频率高达0.00013，远超adRP患病率（1/4000），且AlphaMissense致病性评分仅为0.374，支持其良性分类。

结论与讨论

本研究通过多组学技术验证了RP9 p.(H137L)作为剪接因子相关adRP的致病性，解决了长达二十余年的争议。值得注意的是，RP9在gnomAD中存在大量良性功能缺失变异，提示其致病机制可能为特定残基的功能获得性效应，而非单倍体不足。这一发现与PRPF31等剪接因子相关RP的不完全外显特征一致，进一步支持视网膜特异性剪接调控异常是此类疾病的核心机制。

临床层面，研究强调了在高度同源伪基因区域需结合长读长测序与单倍型分型以规避误诊，并为ACMG准则中PS4/PP1证据的权重分配提供了实践案例。未来需在更多人群中筛查RP9新发致病变异，并通过体外剪接实验进一步明确p.(H137L)的分子病理机制。

（全文约1980汉字）