发酵虫草菌丝体中的多糖：通过部分酸水解、甲基化和核磁共振光谱技术进行深入的结构表征

《Food Frontiers》：Polysaccharides From Fermented Cordyceps Mycelium: In-Depth Structural Characterization by Partial Acid Hydrolysis, Methylation and NMR Spectroscopy

冬虫夏草发酵菌丝体多糖通过凝胶渗透色谱和离子交换色谱分步纯化，结合HPSEC、部分酸水解、甲酰化分析和核磁共振技术，揭示了CSP-2多糖具有高度分支的α-(1→6)-曼诺糖主链，支链位于C-2和C-4位，由葡萄糖、半乳糖和曼诺糖组成。该研究为冬虫夏草多糖的结构解析及资源利用提供了基础数据。

　　**解读：发酵虫草菌丝体中多糖的结构研究**

在传统中医药领域，虫草菌（*Cordyceps sinensis*）一直被认为是一种具有显著生物活性的珍贵药材。虫草多糖作为其主要活性成分之一，不仅在药理作用方面表现出广泛的应用价值，还因其复杂的结构和多样的功能特性而备受关注。然而，由于虫草自然生长环境特殊，其产量有限，导致野生虫草资源日益紧张。因此，近年来许多研究致力于人工培养虫草菌，以获取更稳定的多糖来源。在这些研究中，一种由菌丝体提取的多糖，称为“金水宝胶囊”，因其具有类似野生虫草的药理特性而被广泛使用。为了深入理解这些多糖的化学结构，本研究采用多种技术手段，对人工培养的虫草菌丝体中多糖进行了系统的分离与结构分析，从而揭示其分子组成与结构特征。

### 一、多糖的分离与纯化

本研究首先通过热水提取和乙醇沉淀的方法从发酵的虫草菌丝体中提取粗多糖，随后使用Sevag法去除蛋白质，得到纯化的水提取多糖（CSP）。通过Sephadex G-200凝胶渗透色谱和DEAE-52纤维素阴离子交换色谱，进一步对CSP进行分离和纯化。结果表明，分离出的三种多糖（CSP-1、CSP-2和CSP-3）具有不同的分子量（CSP-1为2.95×10^6 Da，CSP-2为3.06×10^4 Da，CSP-3为6.4×10^3 Da），但它们在化学组成上表现出相似的特性。其中，CSP-2因其具有较为灵活且规则的链结构，被选为后续进一步纯化的重点对象，最终获得高纯度的CSP2-F0.05。通过这些方法，研究人员能够对不同分子量的多糖进行分类，并进一步分析其化学组成和结构特征。

### 二、多糖的化学组成分析

为了进一步了解多糖的分子构成，研究人员对CSP-1、CSP-2和CSP-3进行了总糖含量、尿糖酸含量、蛋白质含量以及总酚含量的测定。结果显示，CSP-1和CSP-2的总糖含量分别为75.97%和83.98%，其中CSP-2含有较高的糖类组成，主要由葡萄糖、甘露糖和半乳糖构成，比例为42.27%:7.87%:39.86%。相比之下，CSP-3的总糖含量较低，仅为67.92%，但其总酚含量却显著高于其他两种多糖（1.73%）。这一结果表明，CSP-3可能具有更丰富的生物活性成分，尤其在抗氧化和抗炎方面可能表现更突出。

此外，对CSP2-F0.05及其部分酸水解产物（CSP2-F0.05-H）的进一步分析表明，其主要由半乳糖、葡萄糖和甘露糖构成，比例为42.27%:17.87%:39.86%。通过部分酸水解处理，研究人员能够观察到某些支链和末端的糖类成分发生变化，例如半乳糖的含量降低，而甘露糖的含量增加。这表明，酸水解能够有效去除部分非主要结构的糖基，从而揭示多糖的主链结构。此外，通过对糖残基的甲基化分析和气相色谱-质谱检测，研究人员能够识别出多种糖苷键的类型，包括1,2-甘露糖苷键、1,6-甘露糖苷键、1,4-甘露糖苷键等，这些糖苷键的存在进一步说明了多糖结构的复杂性。

### 三、多糖的结构解析

为了更精确地解析多糖的结构，研究人员采用了一套综合的分析策略，包括高分辨率的1D和2D核磁共振（NMR）光谱技术。通过NMR光谱，研究人员能够识别出多糖中各个糖残基的化学位移，并据此推测其连接方式。例如，在CSP2-F0.05的1D NMR光谱中，半乳糖（Galp）和葡萄糖（Glc）的化学位移分别出现在5.08 ppm和4.85 ppm，而甘露糖（Manp）的化学位移则集中在4.57 ppm和4.42 ppm。这些信号的出现表明，多糖的主链主要由α-(1→6)-甘露糖苷键构成，而半乳糖和葡萄糖则可能位于支链中。

进一步的2D NMR分析显示，CSP2-F0.05的多糖具有复杂的结构，其中一些糖残基（如α-1,2-Manp、α-1,4,6-Manp）的化学位移在COSY和TOCSY光谱中具有显著的交叉峰，表明这些糖残基之间存在直接的连接关系。同时，HSQC和HMBC光谱帮助研究人员确认了各个糖残基的碳-氢连接模式。例如，在CSP2-F0.05中，α-1,6-Manp的化学位移在C-2和C-6之间显示出明显的相关性，而α-1,4,6-Manp的C-4则与C-1之间存在交叉峰，进一步表明其结构特征。

对于CSP2-F0.05-H（部分酸水解后的产物），NMR分析揭示了其主链结构主要由α-(1→6)-甘露糖苷键构成，而半乳糖和葡萄糖则可能作为支链末端存在。通过比较CSP2-F0.05和CSP2-F0.05-H的NMR数据，研究人员确认了多糖的主链结构，同时发现部分酸水解有助于去除非主链成分，从而更清晰地揭示其主链结构。

### 四、多糖的结构特征与功能关系

通过综合分析，研究人员得出结论：发酵虫草菌丝体中的多糖是一种高度分支的复杂多糖，其主链主要由α-(1→6)-甘露糖苷键构成，而支链则主要在C-2和C-4位置发生。半乳糖和葡萄糖可能位于这些支链末端。这一结构特征与之前对野生虫草多糖的研究结果有所不同，表明人工培养的菌丝体多糖具有独特的结构组成。

这种高度分支的多糖结构可能与其生物活性密切相关。例如，CSP-2在之前的研究中表现出对肠道屏障损伤和结肠炎模型小鼠的显著保护作用，同时也显示出对HCT116细胞增殖的抑制效果，可能与诱导细胞凋亡和自噬流阻断有关。这些生物活性的实现可能与多糖的分子量、糖苷键类型以及支链结构密切相关。此外，CSP-3由于其较高的总酚含量，可能具有更强的抗氧化能力，这也为其潜在的药理应用提供了新的研究方向。

### 五、研究的意义与展望

本研究通过系统的分离、纯化和结构分析，首次较为全面地揭示了发酵虫草菌丝体中多糖的化学结构。这一成果不仅为理解虫草多糖的化学基础提供了重要信息，还进一步阐明了野生与发酵虫草多糖之间的差异，以及不同菌株培养的多糖结构变化。此外，通过对比不同分子量的多糖，研究人员发现，CSP-2具有较高的纯度和清晰的结构特征，适合用于后续的深入研究和药理功能验证。

研究还表明，通过“部分酸水解-甲基化-NMR光谱分析”这一策略，可以有效解析多糖的复杂结构。这一方法不仅适用于虫草多糖，也可能为其他复杂多糖的研究提供参考。未来，进一步研究这些多糖在体内的代谢途径及其对不同疾病模型的干预效果，将有助于推动虫草多糖在医药和保健品领域的应用。

综上所述，本研究通过先进的分离和分析技术，揭示了发酵虫草菌丝体中多糖的结构特征，为后续的药理研究和开发提供了重要的理论依据。同时，研究结果也为其他复杂多糖的结构解析提供了新的思路和方法。