综述：结核病药物发现中的骨架跃迁：原理、应用与案例研究

《Journal of Medicinal Chemistry》：Scaffold Hopping in Tuberculosis Drug Discovery: Principles, Applications, and Case Studies

本综述系统阐述了骨架跃迁（Scaffold Hopping）策略在抗结核（TB）药物研发中的创新应用。通过结构修饰分子骨架，在保留生物活性的同时优化药代动力学（PK）特性、降低毒性并克服耐药性。文章结合案例深入分析了针对关键靶点（如DprE1、QcrB、MmpL3、ATP合酶和20S蛋白酶体）的四种跃迁策略（1°-4°），并强调计算机辅助工具（如LBVS/SBVS）在驱动新型抗结核药物发现中的核心作用，为应对多药耐药结核（MDR-TB）和广泛耐药结核（XDR-TB）挑战提供了新思路。

　　

Scaffold Hopping

骨架跃迁是一种在药物发现过程中用于先导化合物优化的关键药物化学策略。它通过对现有活性化合物的分子骨架进行结构修饰，产生全新的化学类型。其基本原理是：若结构迥异的化合物能与原始分子共享关键的配体-靶点相互作用，则它们可保持对同一生物靶点的活性和亲和力。从药物化学家的视角来看，该方法为解决现有活性先导化合物的多种缺陷提供了独特可能性，例如溶解性差、合成难度大、毒性高、获得性耐药和代谢不稳定等。此外，骨架跃迁避免了重复使用筛选方法，这些方法通常既不经济也不高效。它还能克服为未修饰形式的天然产物获取专利权的挑战，并扩展公司的知识产权（IP）空间。

该术语由Schneider于1999年首次使用，其概念可理解为早期1900年代Langmuir、Grimm和Erlenmeyer定义的等排体替换策略的延伸，并进一步吸纳了Friedman于1951年和Thornber于1979年阐述的生物电子等排原理。用于骨架跃迁的方法多种多样，其复杂程度差异显著。最简单的骨架跃迁通常由药物化学家形成的假设所指导。这些修改无需计算机辅助，涉及杂环骨架内杂原子的移位、添加或移除杂原子以及环的闭合或打开。此类修改通常足以推断药效团，但无法量化分子相似性、形状和电子分布。

相比之下，计算机（in silico）驱动的骨架跃迁利用先进的建模算法，如形状匹配、药效团建模、片段替换和相似性搜索，以更系统地探索化学空间。这些计算机方法依赖于现代药物发现中广泛使用的计算工具，包括虚拟筛选（VS），其基于预测的与生物靶点的结合亲和力来优先选择替代骨架。存在两种主要方法：（i）基于配体的虚拟筛选（LBVS）和（ii）基于结构的虚拟筛选（SBVS）。LBVS利用分子指纹和相似性评估（例如，Tanimoto分数）来识别具有对蛋白质结合关键相似化学特征的候选骨架。SBVS使用来自所有来源的3D结构数据，包括X射线晶体学、NMR光谱和蛋白质数据库（PDB），来模拟受体-配体相互作用。分子对接是SBVS的核心技术，它预测小分子（通常从商业库如PubChem、ChEMBL或ZINC等获得）与蛋白质靶点之间结合模式并估计相互作用强度。SBVS是一种经过验证的用于骨架跃迁应用的工具，在过去十年中受到特别关注，原因是结构生物学和基因组学的显著进步促进了对许多已验证生物靶点3D结构的更深入理解。

然而，在骨架跃迁中使用计算机方法也有其局限性；包括评分函数准确性、可能误读替代骨架、未能反映新骨架潜在的脱靶相互作用，以及通常强烈依赖准确的输入数据。如果骨架跃迁由计算驱动，整个过程成功的前提严重依赖于对分子中被视为骨架的部分的准确定义。第一个全球接受的分子支架定义由Bemis和Murcko（BM scaffolds）于1996年提出。尽管有其局限性，它已成为计算分析的坚实基础。HierS方法（使用拓扑化学图进行分层支架聚类）建立在生成BM支架的算法之上，解决了提取分子核心中的某些模糊性。该方法通过将原始BM支架分解为所有可能的环片段，系统地将相关支架组织到一个统一的网络框架中。作为HierS方法的替代方法，Scaffold Tree Algorithm系统地分解BM支架。Scaffold Tree Algorithm以树图的形式提出支架可能的 structural variations。

Classification of Scaffold Hopping

从历史角度来看，文献中广泛理解的骨架跃迁涵盖了从常规的生物电子等排替换到显著结构 overhaul 的广泛修饰谱。然而，这些方法之间的区别常常是模糊的，过程的定义主要留给药物化学家自行决定。这种模糊性在2012年被Sun及其同事澄清。这项工作强调，作为骨架跃迁提出的结构变化 exclusively 旨在修改分子的核心。此外，作者提出根据结构核心变化相对于母体分子的类型，将骨架跃迁分为四度（1°–4°）。他们还为在整个药物开发领域中对个体案例研究进行分类建立了一个实用框架。Sun及其同事定义的每一度骨架跃迁将在以下章节简要讨论。示例如图1所示。

异环替换（1°骨架跃迁，图1a） 代表了骨架跃迁的最简单形式，并常用于结构-活性关系（SAR）研究，成功率相对较高。该方法涉及在分子骨架内杂原子的取代、添加或移除，以及用一个高度相似的杂环替换另一个杂环。它保留了未改变的药效团和相邻基团的空间排列，从而能够调节理化性质、优化药代动力学（PK）谱并识别关键的配体-靶点相互作用。尽管对母体骨架的修改通常是微小的并且可能缺乏显著的新颖性，但这些变化通常需要不同的合成方法。因此，根据Boehm等人的说法，这些修改可以被认为是新颖的。支持这一说法的证据是磷酸二酯酶5型（PDE5）抑制剂西地那非和伐地那非之间的强烈结构相似性，它们仅在一个氮原子的位置上不同，但却被不同的专利所覆盖。然而，骨架内如此小的结构修改通常导致性质变化有限，并且在建立强大的IP地位方面提供最小优势。

开环和闭环方法（2°骨架跃迁，图1b） 涉及调节分子骨架的构象灵活性，朝着更复杂的结构变化前进以创建新骨架。应用闭环方法增强了分子刚性，从而降低了结合自由能的熵分量，这通常改善了靶点 engagement。此外，减少分子的灵活性可以防止不良的脱靶相互作用。另一方面，新创建骨架缺乏灵活性可能对溶解度和ADME性质产生负面影响。相反，开环方法与增加的分子灵活性相关，允许开环类似物更有效地占据动态结合口袋。通常，2°骨架跃迁是控制结构中自由可旋转键或环的数量并提升分子类药特性的宝贵工具。

3°骨架跃迁（图1c），也称为拟肽或伪肽，专注于对肽和蛋白质一级结构的修饰。这些结构变化涉及用能够维持肽链空间排列（如α-螺旋和β-折叠）的小结构 motif 替换氨基酸，确保其与生物靶点二级结构相互作用的能力。这种方法的特点在于解决天然肽和蛋白质的主要局限性，包括代谢稳定性差、蛋白酶快速降解、选择性问题和口服生物利用度有限。

4°骨架跃迁（图1d） 包括对先导候选物核心的彻底结构 overhaul，并且几乎完全由计算机方法驱动。该方法的应用产生了一个全新的、不相关的骨架，该骨架仅保持关键的配体-靶点相互作用、静电性质和分子的整体3D形状。虽然这种方法看起来非常有前途，具有克服IP障碍和解决当前疗法耐药机制的潜力，但文献中很少报道。这可能是因为重大的结构变化通常伴随着较低的成功率，导致案例研究较少。此外，VS和4°骨架跃迁是互补的策略，通常应用于药物发现过程的不同阶段。虽然VS通常用于命中识别，但骨架跃迁在命中到先导优化中扮演关键角色。越来越多地，这些方法与诸如对接指导支架修改等技术互补使用。

由于计算机方法被广泛涉及，特别是在更高度数的骨架跃迁中，许多软件工具已被开发以促进个体骨架跃迁策略的有效应用。例如，CAVEAT和Cresset Spark工具广泛用于识别合适的支架替换，利用构象和静电特性来指导选择过程。从天然产物进行骨架跃迁通常通过WHALES（加权整体原子定位和实体形状）实现，这是一种基于相似性的方法，旨在生成新的合成模拟物。尽管在骨架跃迁第一度中使用计算机方法并不总是必要的，但具有类药物支架库的MORPH方法可以指导药物化学家进行更合理的杂环替换并提高成功率。

尽管上述内容仅提供了对骨架跃迁的简要洞察，但它提供了在此视角中进一步定位所需的足够信息。它增强了对其作为跨文献应用的概念的理解。

The Aim and Scope of the Review

本视角旨在分析和讨论过去二十年中骨架跃迁在结核病新疗法发现各个发展阶段的应用。本视角中包含的案例研究不仅基于母体分子及其骨架衍生类似物的临床相关性进行选择，而且还基于捕获相应化合物类别完整开发背景的综合数据和文献的可用性。所选的化合物家族允许在分子内明确识别骨架，遵循Bemis和Murcko提出的骨架定义算法。虽然结核病领域的药物发现工作涵盖了大量涉及骨架跃迁的研究，但在此视角范围内几乎不可能全部包含。尽管如此，所选的案例研究代表了相关的化合物类别，并为在药物设计背景下应用骨架跃迁提供了清晰的理由。对于个体骨架跃迁，将重点放在先导化合物核心内的修饰和结构考虑上，这些修饰导致了所需性质的改变，如提高疗效、降低毒性或改善溶解度，同时还将解决药物发现过程中遇到的相关局限性和挑战。为了改进个体案例研究中母体分子和新衍生物的活性参数（例如，MIC、IC₅₀）、细胞毒性（例如，IC₅₀）和其他评估属性的可比性和评估，某些原始值已被重新计算并标准化为统一单位，摩尔浓度[M]。在适用的情况下，导致新化学实体形成的结构修饰的影响将根据它们在配体-蛋白质复合物内的结合相互作用进行评估，并伴随与母体分子的比较分析。为便于在文本中导航，突出显示迄今为止结核病药物开发中骨架跃迁最新进展的个体案例研究根据Sun及其同事提出的分类框架进行分类。

Application of Scaffold Hopping in TB Drug Discovery

1° Scaffold Hopping

鉴于大部分药物含有至少一个杂环，一度骨架跃迁被广泛利用，并经常考虑用于建立SAR、增加合成可及性、解决临床前开发中先导分子的关键缺陷以及扩展IP空间。

靶向Mtb的能量代谢是开发新结核病药物的一个有前景的策略。细胞色素bcc是分枝杆菌呼吸系统的关键组成部分，在电子传递链（ETC）和ATP合成中起着 essential 作用。抑制细胞色素bcc会破坏质子动力（PMF），停止ATP生产。值得注意的是，细胞色素bcc的QcrB亚基已成为抗结核药物的关键靶点，其中最先进的抑制剂Q203（telacebec；图2）目前正在进行II期临床试验。

Q203是Pethe等人发现的咪唑并吡啶类成员，表现出强大的抗分枝杆菌活性（Mtb H₃₇Rv MIC₅₀ = 2.7 nM，培养21天后）、低hERG（人体 ether-a-go-go 相关基因）抑制（hERG IC₅₀ > 30 μM）和良好的药代动力学（PK）特性。由于Q203选择性抑制细胞色素bcc，它充当抑菌剂。Tang等人对Q203应用了骨架跃迁方法，通过将氮从4位转移来修改咪唑并吡啶核心，创建了新型吡唑并吡啶类化合物，从而鉴定出先导化合物TB47（图2）。TB47中的新吡唑并吡啶骨架保留了与原始结构相似的3D构象和电子特性，保持了与QcrB的Glu314残基的关键H键。TB47对DR-TB菌株表现出持续的疗效，并对Mtb表现出与Q203相当的活性（MIC₉₀ H₃₇Rv = 11.1 nM，7天后），低心脏毒性（hERG IC₅₀ > 30 μM），与Q203相比clogP值降低了10倍，并在小鼠模型中具有良好的口服生物利用度。

2016年，Moralski等人也在其SAR研究中对Q203应用了骨架跃迁，以生成新的先导化合物ND-1543（图2），该化合物带有咪唑并[2,1-b]噻唑骨架，同时保留了其对QcrB的抑制活性。ND-1543对复制期Mtb显示出与Q203相当的活性（MIC H₃₇Rv = 8 nM），在最大测试浓度下无细胞毒性（CC₅₀ VERO细胞 >100 μM），不抑制主要CYP酶（IC₅₀值 > 10 μM），并在人肝微粒体（HLMs）中显示出中等稳定性（T _1/2 = 28分钟）。然而，ND-1543在体内（BALB/c小鼠）表现出相对较差的PK谱，并且在慢性TB感染的BALB/c小鼠模型中也疗效不佳，口服200 mg/kg剂量30天后，与未治疗的对照组相比，肺部细菌负荷减少了0.3 log₁₀ CFU。显然，这种简单且经过验证的方法也可能产生不太有利的化合物。

Mtb拥有独特的细胞壁结构，由厚的肽聚糖层连接至阿拉伯半乳聚糖和富含霉菌酸的外膜组成。此外，细胞壁还包括 essential 成分，如脂阿拉伯甘露聚糖和脂甘露聚糖。细胞壁的不渗透性和结构坚固性赋予Mtb独特的、先天的、非特异性抗菌剂耐药性，对开发新的抗结核药物构成了重大挑战。另一方面，Mtb细胞壁包含许多酶和转运蛋白，可作为治疗干预的有希望的独特靶点。因此，设计破坏分枝杆菌细胞壁生物合成的药剂代表了结核病治疗的高度有效策略。

Decaprenylphosphoryl-β-d-ribose 2?-epimerase（DprE1；EC 1.1.98.3）是 crucial 酶复合物的一部分，它催化decaprenylphosphoryl-β-d-ribose（DPR）向decaprenylphosphoryl-β-d-arabinose（DPA）的差向异构化，这是生成阿拉伯半乳聚糖和脂阿拉伯甘露聚糖的生物合成途径中的 essential 步骤。抑制该靶点代表了一种有前景的策略来破坏细胞壁合成。科学努力已导致开发出四种以抑制DprE1为核心作用机制（MoA）的临床候选药物。这些包括非共价抑制剂1,4-氮杂吲哚TBA-7371（II期）和3,4-二氢卡波斯特里尔衍生物OPC-167832（quabodepistat，II期），以及来自苯并噻嗪酮家族的共价抑制剂，如BTZ-043（II期）和PBTZ-169（macozinone，II期）。

TBA-7371（图3a）是由阿斯利康研究人员发现的1,4-氮杂吲哚衍生物，通过质谱分析被鉴定为DprE1的非共价抑制剂。TBA-7371不仅显示出对DprE1的有效酶抑制（IC₅₀ DprE1 = 10 nM），而且还具有良好的全细胞活性（MIC H₃₇Rv = 0.78 μM）。然而，随后的研究表明，该衍生物也抑制磷酸二酯酶6（PDE6 IC₅₀ = 4 μM），引起了潜在眼部副作用的担忧。随后，同一研究小组对TBA-7371应用了骨架跃迁，将氮杂吲哚核心内的N4氮转移到N3位置，并将酰胺侧链从C3位置移动到C4位置。这种结构修饰产生了具有苯并咪唑（BI）骨架的化合物1（图3a）。TBA-7371和BI类似物1的叠加显示，新衍生物1保留了与TBA-7371相似的结合模式。TBA-7371在DprE1活性位点内的相互作用机制是通过使用与TCA1复合的DprE1晶体结构（PDB ID：4KW5）进行对接研究提出的。这种预测的结合相互作用的特点是氮杂吲哚的吡啶环与Tyr314之间的CH-π接触，以及涉及N4原子、酰胺侧链的羰基氧和Ser228的分叉氢键。此外，酰胺NH与氧化还原辅因子黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）形成氢键接触，而末端OH基团位于与Asn385的氢键距离内。在1中将酰胺侧链从C4位反式到C3位保持了足够的接近度以形成1中羰基氧与Ser228之间的关键氢键，并且1中BI的不饱和六元环保留了与Tyr314的CH-π相互作用。新BI类似物1的相似空间排列保留了酰胺NH基团与FAD之间的原始氢键，以及BI衍生物1中末端氟原子与Asn385的紧密接近。1的生物学评估显示MIC值比TBA-7371高2倍（MIC H₃₇Rv = 1.56 μM）。1的生物学靶点是通过测试1对1,4-氮杂吲哚耐药菌株（具有Y314H突变的DprE1）间接确定的。与野生型Mtb相比，观察到MIC的显著变化（MIC H₃₇Rv = 1.56 μM vs MIC DprE1-Y314H = 25 μM），表明1与TBA-7371共享相同的MoA。化合物1也在慢性TB感染的BALB/c小鼠模型中进行了体内评估。1的疗效通过在30 mg/kg剂量下治疗4周后，肺部细菌负荷减少1.5 log₁₀ CFU和脾脏减少1.0 log₁₀ CFU得到证明。值得注意的是，1显示出有限的CYP和hERG抑制（CYPs IC₅₀值 > 50 μM (21A2, 2C9, 2C19, 2D6, 3A4)；hERG IC₅₀ > 33 μM），并在大鼠中具有优异的口服生物利用度（F _oral = 114%）。

BTZs类由V. Makarov和S. T. Cole于2009年首次发现。他们的努力导致了两种临床候选药物的开发，BTZ-043及其相关化合物PBTZ-169（macozinone）（图3b）。这些化合物通过抑制DprE1靶向细胞壁合成，作为需要在原位还原的前药，从其各自的硝基生成反应性亚硝基衍生物。这些衍生物通过与DprE1酶中Cys387残基的半胱氨酸的巯基反应形成半硫缩醛加合物，从而与酶形成共价键，导致酶的不可逆失活（图3b）。因此，该类代表共价DprE1抑制剂。BTZ-043是一种高效的DprE1体外抑制剂，对Mtb H₃₇R_v、MDR-和XDR-TB菌株表现出一致的活性（MIC = 2.3 nM）。BTZ-043目前正在进行II期临床试验。然而，BTZ-043异常低的MIC值及其体内疗效并未持续，并且该化合物的几个缺点出现，例如存在手性中心和相对较高的合成成本。所有这些方面导致研究人员进一步研究BTZ-0432位的修饰。这些努力导致了共价DprE1抑制剂2-哌嗪基-苯并噻嗪酮PBTZ-169（macozinone）的发现，该药目前处于II期临床试验。PBTZ-169缺乏手性中心且合成成本较低，表现出改善的细胞毒性谱（PBTZ-169 TD₅₀ HepG2 = 127 μM vs BTZ-043 TD₅₀ HepG2 = 12 μM）、更高的效力（Mtb H₃₇Rv MIC₉₉ = 0.65 nM），并且在慢性TB小鼠模型中在较低浓度下与BTZ-043相比显著提高了疗效。PBTZ-169与DprE1的共晶结构（PDB ID：4NCR）显示，提供DprE1活性位点内关键相互作用的分子 essential 片段涉及硫原子、噻嗪酮环内的羰基、6位的强吸电子CF₃基团和8位不可或缺的硝基。然而，3位的氮原子不参与与酶的直接相互作用。基于这一观察，Peng等人应用骨架跃迁，用生物等排碳原子替换3位的氮，并用生物等排氧替换硫原子。这些修饰导致了PBTZ-169的三个结构类似物的开发，它们带有苯并噁嗪（化合物2）、苯并硫吡喃酮（化合物3）和苯并吡喃酮（化合物4）骨架，同时保留了CF₃和硝基的原始位置（图3b）。与PBTZ-169相比，苯并噁嗪衍生物2显示活性降低了1个数量级（化合物2 Mtb MIC H₃₇Rv = 0.36 μM vs PBTZ-169 Mtb MIC H₃₇Rv < 0.035 μM， respectively）和更高的体外细胞毒性（化合物2 IC₅₀ Vero = 118 μM vs PBTZ-169 IC₅₀ Vero >140 μM， respectively）。同样，用带有苯并吡喃酮的类似物4替换PBTZ-169中的苯并噻嗪酮导致细胞毒性显著增加（化合物4 IC₅₀ Vero = 24 μM vs PBTZ-169 IC₅₀ Vero >140 μM）和活性降低8倍（化合物4 Mtb MIC H₃₇Rv = 0.264 μM vs PBTZ-169 Mtb MIC H₃₇Rv < 0.035 μM）。这表明硫原子对于维持BTZ类良好的体外安全性和活性是 essential 的。相反，用苯并硫吡喃酮3替换PBTZ-169中的苯并噻嗪酮骨架是Peng等人工作中展示的成功骨架跃迁示例。确实，3在PBTZ-169的三个衍生物中表现出最高的活性（Mtb MIC H₃₇Rv < 0.025 μM），同时还表现出最低的细胞毒性（IC₅₀ Vero >140 μM）。此外，使用急性TB感染的BALB/c小鼠模型对3进行的体内评估显示，在100 mg/kg剂量下治疗3周后，肺部细菌负荷显著减少了5.4 log₁₀ CFU。然而，与PBTZ-169一样，衍生物3表现出非常低的生物利用度（F _oral = 13%）。3的有利安全数据表明心脏毒性风险低（hERG IC₅₀ > 30 μM）和有限的CYP酶抑制（CYPs IC₅₀ > 50 μM；1A2, 2C9, 2C19, 2D6, 3A4）。

分枝杆菌膜蛋白大3（MmpL3）是抗性、结节化和分裂（RND）蛋白超家族的成员，在几种细胞过程中起着至关重要的作用，包括能量代谢和细胞稳态。MmpL3还参与分枝杆菌细胞壁合成，在那里它作为转运蛋白发挥作用。这种RND转运蛋白利用PMF从细胞质转运海藻糖单霉菌酸酯（TMM）。TMM随后作为霉菌酸转移酶的底物，这些酶对霉菌膜成分的生物合成至关重要，而霉菌膜成分对于维持分枝杆菌细胞壁的结构完整性是 essential 的。抑制MmpL3导致Mtb死亡，使其成为潜在抗结核药物的合适靶点。MmpL3抑制剂家族涵盖多种化合物，包括羧酰胺衍生物（NITD-304和NITD-349）、金刚烷基脲（AU1235）、吡咯（BM212, BM635）和苯并咪唑（C215）。值得注意的是，最先进的MmpL3抑制剂乙二胺衍生物SQ109目前正在进行II期临床试验。

第一个来自1,5-二苯基吡咯类的MmpL3抑制剂化合物BM212（图4）是通过随机筛选唑类化合物库鉴定的。BM212对复制期Mtb菌株表现出中等活性（MIC H₃₇Rv = 5 μM）。与SQ109、C215和其他MmpL3抑制剂类似，BM212也表现出PMF解偶联效应，并且 additionally 在低氧条件下生长的非复制期Mtb菌株显示出活性（MIC Mtb H₃₇Rv = 18.5 μM；LORA测定）。随后的SAR研究导致了化合物BM635的开发（图4），显示出亚微摩尔活性（Mtb MIC H₃₇Rv = 0.12 μM）和可接受的安全谱（CC₅₀ HepG2 = 40 μM；hERG IC₅₀ = 10 μM）。BM635还在急性TB感染的小鼠模型中显示出疗效，在50 mg/kg剂量下治疗8天后，肺部减少了2.0 log₁₀ CFU。然而，BM635表现出非常低的动力学溶解度（CLND溶解度 <1 μM），限制了其进一步开发的潜力。为了克服这一限制，通过改变中央吡咯环内N1位的取代来修饰BM635的结构。将BM635 N1位的原始4-氟苯基替换为异丙基部分，导致了化合物5的开发（图4）。化合物5表现出相当的体外活性（Mtb MIC H₃₇Rv = 0.15 μM）和体内疗效（在急性TB感染小鼠模型中，50 mg/kg剂量治疗8天后肺部减少1.5 log₁₀