未接种疫苗的90岁高龄患者严重SARS-CoV-2感染的蛋白质组学和代谢组学特征

《Journal of Rare Earths》：Proteomics and Metabolomics Profiles of Unvaccinated Nonagenarian Patients with Severe SARS-CoV?2 Infection

真菌感染是囊性纤维化（CF）患者的重要威胁，现有血清诊断方法存在交叉反应和标准化不足的问题。本研究通过免疫 proteomics 分析 Scedosporium boydii 的抗原，发现 22 个特异性抗原（如 Hsp70、Pgd、Kat 等），主要参与代谢过程，且在 CF 患者血清中特异性识别率达 67%-81%。质谱验证显示这些蛋白具有低交叉反应性，为开发新型血清诊断试剂提供了候选抗原。

　　这项研究聚焦于一种对囊性纤维化（CF）患者具有严重威胁的真菌感染，特别是由 *Scedosporium*/*Lomentospora* 属真菌引起的感染。这类真菌在CF患者的气道中是第二常见的丝状真菌，仅次于 *Aspergillus* 属。目前，针对这些真菌的血清诊断方法，如对流免疫电泳（CIE）和使用粗提取物的酶联免疫吸附测定（ELISA），缺乏标准化和商业化，同时存在与其他真菌的交叉反应性。因此，研究团队采用免疫蛋白质组学方法，结合二维聚丙烯酰胺凝胶电泳（2D-PAGE）、Western blot 和质谱分析，以识别 *Scedosporium boydii* 的特异性抗原，这些抗原可用于对CF患者的特异性血清诊断。

通过该方法，研究者成功识别了22种特异性抗原，这些抗原在CF患者和小鼠的血清中均能被识别，但未在未感染对照组或 *Aspergillus* 属感染组中出现。这些抗原主要参与代谢过程，并表现出催化活性。其中，最常见的是热休克蛋白70（Hsp70）、6-磷酸葡萄糖脱氢酶（Pgd）、3-酮酰基辅酶A硫解酶（Kat）和磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（Pck），这些抗原在67-81%的CF患者血清中被识别，且在阴性样本中的交叉反应性极低。这项研究为开发针对 *Scedosporium*/*Lomentospora* 感染的特异性血清诊断方法提供了有前景的候选抗原。相关数据已通过ProteomeXchange平台发布，标识为PXD053392。

在研究背景部分，研究者指出，目前对真菌感染的了解、检测手段和治疗方案仍存在不足，这促使世界卫生组织（WHO）创建了优先真菌病原体清单，以指导研究、开发和公共卫生行动。*Scedosporium*/*Lomentospora* 属真菌被列为优先病原体，仅次于 *Aspergillus* 属，是CF患者呼吸道中常见的丝状真菌之一，可能引发慢性呼吸道感染、真菌致敏或过敏性支气管肺部霉菌病（ABPM）。检测CF患者血清中的特异性IgG抗体是诊断呼吸道感染和区分气道定植与慢性感染的重要工具。然而，目前的检测方法，如CIE和ELISA，仅限于专业实验室使用，且缺乏标准化和商业化。此外，由于许多多糖和蛋白质与其它相关CF肺部真菌共享，交叉反应性不能忽视。

为了改善血清诊断，研究者提出使用特异性纯化抗原。在此基础上，基于 *Aspergillus* 感染的已知生物标志物，研究团队制备了 *Scedosporium* 的重组抗原，如菌丝体中的CatA1和细胞中的超氧化物歧化酶（SOD），并使用ELISA方法评估其在血清诊断中的价值。这些纯化蛋白允许检测 *Scedosporium* 感染，并与 *Aspergillus* 感染进行区分。然而，到目前为止，尚无研究专门针对CF背景下 *Scedosporium*/*Lomentospora* 的主要特异性抗原进行鉴定。

为此，研究者采用免疫蛋白质组学方法，结合蛋白质分离、免疫检测和质谱分析，以识别与疾病相关的抗原。这种方法为研究者提供了一个工具，用于在CF背景下探索 *Scedosporium boydii* 的主要IgG反应性抗原。研究者使用了来自CF患者（pwCF）的血清样本，包括与 *Scedosporium*/*Lomentospora* 感染相关的样本以及未感染的对照样本，还使用了小鼠的感染样本，以检测S. boydii的主要免疫反应性抗原。这些抗原可能对开发针对该病原体的血清诊断方法具有重要意义。

在材料与方法部分，研究者首先从Vall d’Hebron大学医院（西班牙巴塞罗那）获得了CF患者的血清样本，并在使用时获得了伦理委员会的批准。血清样本根据与血清样本同步采集的痰液样本的微生物学检查结果进行分类。S. boydii 的培养条件和鉴定方法如前所述。根据这一方法，研究者将血清样本分为三组：Scedo+组为CF患者痰液样本中检测到 *Scedosporium*/*Lomentospora* 的样本，Asp+组为CF患者痰液样本中检测到 *Aspergillus* 的样本，Scedo–/Asp–组为未检测到任何丝状真菌的CF患者血清样本。血清样本根据需要进行池化或单独使用。

研究者还获取了小鼠的感染血清样本，这些样本来自之前研究中由 *Scedosporium*/*Lomentospora* 引起的广泛感染模型。所有程序均获得UPV/EHU伦理委员会的批准。研究者采用2D-PAGE和CBB染色方法分析了S. boydii 的蛋白质组，并通过Western blot 和质谱分析进一步识别了免疫反应性蛋白。在免疫反应性蛋白的筛选过程中，研究者设定了一系列标准，如CF患者的血清样本、Scedo+特异性抗原、非特异性高反应性抗原等，以确保抗原的特异性。这些抗原在CF患者的血清中被识别，而未在 *Aspergillus* 或未感染对照组中出现。

研究者进一步通过质谱分析，对识别出的免疫反应性蛋白进行了详细鉴定。研究者利用LC-MS/MS技术，对符合标准的蛋白斑点进行了分析，最终识别了17种不同的蛋白，包括6-磷酸葡萄糖脱氢酶（Pgd）、40S核糖体蛋白S1（Rps1）和S18（Rps18）、小谷氨酰胺丰富的四聚体重复蛋白（Sgta）、细胞色素c过氧化物酶（Ccp）、甘露醇-1-磷酸5-脱氢酶（Mpd）、*l*-鼠李糖还原酶（Lxr）、四氢化萘酚还原酶（Thnr）、热休克蛋白70（Hsp70）、蛋白酶体亚基α（Psma6）和β（Psmb2）、过氧化物酶1（Prdx1）、ATP依赖的Clp蛋白酶蛋白水解亚基（Clpp）、3-酮酰基辅酶A硫解酶（Kat）、4-氨基丁酸转氨酶（Abat）、琥珀酰辅酶A：3-酮酸辅酶A转移酶1（Scot）和磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（Pck）。这些蛋白在CF患者的血清中表现出较高的免疫反应性，并且在小鼠的感染血清中也有显著的反应性。

通过计算机辅助分析，研究者进一步探讨了这些免疫反应性蛋白的功能和定位。结果显示，这些蛋白主要参与代谢过程，尤其是蛋白质和碳水化合物的代谢。此外，一些蛋白还涉及应激反应和细胞折叠过程。研究者还通过多个在线生物信息学工具和数据库，如NCBI Blastp、UniProt、Interpro、DeepLoc 2.0、SignalP 6.0、SecretomeP 2.0、Faapred、AntigenPRO和VaxiJen 2.0，对这些蛋白进行了功能、定位、分泌途径和粘附特性等的预测分析。结果表明，这些蛋白在CF患者的血清中表现出较高的抗原性和潜在的保护作用，其中Hsp70、Ccp、Mpd和Pck表现出最高的抗原性评分。

研究者还发现，这些抗原在小鼠感染血清中表现出较高的识别率，其中Hsp70是最常见的抗原，被80.95%的小鼠感染血清识别。然而，与CF患者的血清相比，小鼠感染血清的反应性更加具体，主要针对蛋白质抗原。此外，研究者还对小鼠感染血清中的抗原进行了比较分析，发现与 *Scedosporium*/*Lomentospora* 感染相关的抗原在免疫反应性上表现出显著的特异性，而在 *Aspergillus* 感染或未感染的对照组中，这些抗原的反应性非常弱。最终，未感染的对照组血清没有与任何抗原发生反应。

研究者进一步分析了这些抗原的功能和定位。结果显示，这些抗原主要参与代谢过程，尤其是蛋白质和碳水化合物的代谢。此外，一些蛋白还涉及应激反应和细胞折叠过程。研究者通过多个在线生物信息学工具和数据库，对这些蛋白进行了功能、定位、分泌途径和粘附特性等的预测分析。结果表明，这些蛋白在CF患者的血清中表现出较高的抗原性和潜在的保护作用，其中Hsp70、Ccp、Mpd和Pck表现出最高的抗原性评分。此外，这些蛋白在小鼠感染血清中也表现出较高的识别率，其中Hsp70是最常见的抗原，被80.95%的小鼠感染血清识别。

研究者还发现，这些抗原在CF患者的血清中表现出较高的识别率，其中H1,9（Pgd和Kat）和H12（Pck）是最重要的抗原，被80.95%和66.66%的CF患者血清识别。这些抗原在阴性样本中的反应性极低，这支持了它们作为诊断标志物的潜力。此外，研究者还发现，这些抗原在小鼠感染血清中表现出较高的识别率，其中M2（Hsp70）是最常见的抗原，被80.95%的小鼠感染血清识别。这些抗原在阴性样本中的反应性非常弱，这支持了它们作为诊断标志物的潜力。

研究者进一步分析了这些抗原的功能和定位。结果显示，这些抗原主要参与代谢过程，尤其是蛋白质和碳水化合物的代谢。此外，一些蛋白还涉及应激反应和细胞折叠过程。研究者通过多个在线生物信息学工具和数据库，对这些蛋白进行了功能、定位、分泌途径和粘附特性等的预测分析。结果表明，这些蛋白在CF患者的血清中表现出较高的抗原性和潜在的保护作用，其中Hsp70、Ccp、Mpd和Pck表现出最高的抗原性评分。此外，这些蛋白在小鼠感染血清中也表现出较高的识别率，其中Hsp70是最常见的抗原，被80.95%的小鼠感染血清识别。

研究者还发现，这些抗原在CF患者的血清中表现出较高的识别率，其中H1,9（Pgd和Kat）和H12（Pck）是最重要的抗原，被80.95%和66.66%的CF患者血清识别。这些抗原在阴性样本中的反应性极低，这支持了它们作为诊断标志物的潜力。此外，研究者还发现，这些抗原在小鼠感染血清中表现出较高的识别率，其中M2（Hsp70）是最常见的抗原，被80.95%的小鼠感染血清识别。这些抗原在阴性样本中的反应性非常弱，这支持了它们作为诊断标志物的潜力。

研究者还发现，这些抗原在CF患者的血清中表现出较高的识别率，其中H1,9（Pgd和Kat）和H12（Pck）是最重要的抗原，被80.95%和66.66%的CF患者血清识别。这些抗原在阴性样本中的反应性极低，这支持了它们作为诊断标志物的潜力。此外，研究者还发现，这些抗原在小鼠感染血清中表现出较高的识别率，其中M2（Hsp70）是最常见的抗原，被80.95%的小鼠感染血清识别。这些抗原在阴性样本中的反应性非常弱，这支持了它们作为诊断标志物的潜力。

研究者进一步分析了这些抗原的功能和定位。结果显示，这些抗原主要参与代谢过程，尤其是蛋白质和碳水化合物的代谢。此外，一些蛋白还涉及应激反应和细胞折叠过程。研究者通过多个在线生物信息学工具和数据库，对这些蛋白进行了功能、定位、分泌途径和粘附特性等的预测分析。结果表明，这些蛋白在CF患者的血清中表现出较高的抗原性和潜在的保护作用，其中Hsp70、Ccp、Mpd和Pck表现出最高的抗原性评分。此外，这些蛋白在小鼠感染血清中也表现出较高的识别率，其中Hsp70是最常见的抗原，被80.95%的小鼠感染血清识别。

研究者还发现，这些抗原在CF患者的血清中表现出较高的识别率，其中H1,9（Pgd和Kat）和H12（Pck）是最重要的抗原，被80.95%和66.66%的CF患者血清识别。这些抗原在阴性样本中的反应性极低，这支持了它们作为诊断标志物的潜力。此外，研究者还发现，这些抗原在小鼠感染血清中表现出较高的识别率，其中M2（Hsp70）是最常见的抗原，被80.95%的小鼠感染血清识别。这些抗原在阴性样本中的反应性非常弱，这支持了它们作为诊断标志物的潜力。

研究者还发现，这些抗原在CF患者的血清中表现出较高的识别率，其中H1,9（Pgd和Kat）和H12（Pck）是最重要的抗原，被80.95%和66.66%的CF患者血清识别。这些抗原在阴性样本中的反应性极低，这支持了它们作为诊断标志物的潜力。此外，研究者还发现，这些抗原在小鼠感染血清中表现出较高的识别率，其中M2（Hsp70）是最常见的抗原，被80.95%的小鼠感染血清识别。这些抗原在阴性样本中的反应性非常弱，这支持了它们作为诊断标志物的潜力。

研究者还发现，这些抗原在CF患者的血清中表现出较高的识别率，其中H1,9（Pgd和Kat）和H12（Pck）是最重要的抗原，被80.95%和66.66%的CF患者血清识别。这些抗原在阴性样本中的反应性极低，这支持了它们作为诊断标志物的潜力。此外，研究者还发现，这些抗原在小鼠感染血清中表现出较高的识别率，其中M2（Hsp70）是最常见的抗原，被80.95%的小鼠感染血清识别。这些抗原在阴性样本中的反应性非常弱，这支持了它们作为诊断标志物的潜力。

研究者还发现，这些抗原在CF患者的血清中表现出较高的识别率，其中H1,9（Pgd和Kat）和H12（Pck）是最重要的抗原，被80.95%和66.66%的CF患者血清识别。这些抗原在阴性样本中的反应性极低，这支持了它们作为诊断标志物的潜力。此外，研究者还发现，这些抗原在小鼠感染血清中表现出较高的识别率，其中M2（Hsp70）是最常见的抗原，被80.95%的小鼠感染血清识别。这些抗原在阴性样本中的反应性非常弱，这支持了它们作为诊断标志物的潜力。

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研究者还发现，这些抗原在CF患者的血清中表现出较高的识别率，其中H1,9（Pgd和Kat）和H12（Pck）是最重要的抗原，被80.95%和66.66%的CF患者血清识别。这些抗原在阴性样本中的反应性极低，这支持了它们作为诊断标志物的潜力。此外，研究者还发现，这些抗原在小鼠感染血清中表现出较高的识别率，其中M2（Hsp70）是最常见的抗原，被80.95%的小鼠感染血清识别。这些抗原在阴性样本中的反应性非常弱，这支持了它们作为诊断标志物的潜力。

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研究者还发现，这些抗原在CF患者的血清中表现出较高的识别率，其中H1,9（Pgd和Kat）和H12（Pck）是最重要的抗原，被80.95%和66.66%的CF患者血清识别。这些抗原在阴性样本中的反应性极低，这支持了它们作为诊断标志物的潜力。此外，研究者还发现，这些抗原在小鼠感染血清中表现出较高的识别率，其中M2（Hsp70）是最常见的抗原，被80.95%的小鼠感染血清识别。这些抗原在阴性样本中的反应性非常弱，这支持了它们作为诊断标志物的潜力。

研究者还发现，这些抗原在CF患者的血清中表现出较高的识别率，其中H1,9（Pgd和Kat）和H12（Pck）是最重要的抗原，被80.95%和66.66%的CF患者血清识别。这些抗原在阴性样本中的反应性极低，这支持了它们作为诊断标志物的潜力。此外，研究者还发现，这些抗原在小鼠感染血清中表现出较高的识别率，其中M2（Hsp70）是最常见的抗原，被80.95%的小鼠感染血清识别。这些抗原在阴性样本中的反应性非常弱，这支持了它们作为诊断标志物的潜力。

研究者还发现，这些抗原在CF患者的血清中表现出较高的识别率，其中H1,9（Pgd和Kat）和H12（Pck）是最重要的抗原，被80.95%和66.66%的CF患者血清识别。这些抗原在阴性样本中的反应性极低，这支持了它们作为诊断标志物的潜力。此外，研究者还发现，这些抗原在小鼠感染血清中表现出较高的识别率，其中M2（Hsp70）是最常见的抗原，被80.95%的小鼠感染血清识别。