生物电化学反硝化作用——阴极电位、接种源及硝酸盐负荷率的影响

《Journal of Water Process Engineering》：Bio-electrochemical denitrification – The impact of cathode potential, inoculum source and nitrate loading rate

研究不同阴极电位对生物电化学脱氮（BED）系统性能及微生物群落的影响，发现-1100 mV系统通过氢介导电子传递显著提升硝酸盐去除率至5.41 g NO3?-N m?2 d?1，同时富集氢营养型脱氮菌（如Hydrogenophaga、Dechloromonas），而-700 mV系统以Candidatus Nitrotoga为主，表明电位调控可优化不同脱氮机制。

　　生物电化学系统（Bio-electrochemical systems, BESs）为地下水中的硝酸盐（NO??）去除提供了一种有前景的策略。然而，废水中的有机碳与硝酸盐比例较低时，处理效率常常受到限制。本研究探讨了阴极电位对微生物生物膜发展以及生物电化学脱氮（BED）系统长期运行的影响。BED反应器在两种模式下运行，分别是分批进料和连续进料模式，电位分别设置为-700 mV和-1100 mV（相对于Ag/AgCl），分别诱导直接电子转移（DET）和氢介导的路径（H?-MET）。设置在-1100 mV的BED反应器实现了高达600%的硝酸盐去除率，达到最大去除速率为5.41 ± 0.05 g NO??-N m?2 d?1。微生物群落分析显示，-1100 mV的BED反应器中富含氢营养型脱氮菌（如Hydrogenophaga spp.、Dechloromonas spp.和Simplicispira spp.），而-700 mV的BED反应器则主要由Candidatus Nitrotoga spp.主导，这些菌通常与NO??氧化有关，表明了电活性脱氮的可能性。总体而言，结果表明阴极电位在塑造BED系统中的微生物生物膜群落以及硝酸盐去除性能方面起着关键作用。

### 研究背景与意义

地下水中的硝酸盐污染对社会构成了重大挑战。一方面，它影响了人类饮用水的质量，可能导致婴儿配方奶喂养者的高铁血红蛋白症，同时与结直肠癌的发生有关。另一方面，它会引发生态系统失衡，并增加有毒藻类暴发的可能性。近年来，微生物电化学技术的研究日益受到关注，作为一种可持续的过程，它不仅有助于从废水回收资源，还为环境污染物的生物修复提供了可能。BESs在废水处理厂（WWTPs）中已被广泛研究用于去除氮化合物。这些研究通常使用厌氧消化污泥作为接种物，并利用富含有机碳的废水，其中C/N比和化学需氧量（COD）较高。然而，在硝酸盐污染的地下水中，有机碳浓度通常较低，缺乏可利用的有机电子供体迅速成为去除氮化合物的限制因素。

### 研究方法与实验设计

在本研究中，通过建立电活性生物膜，研究了不同电位对BED系统中硝酸盐去除性能的影响。实验使用了四个平行反应器，分别设置为-1100 mV和-700 mV，以模拟能够或不能进行电化学H?生产的条件。通过这种方式，将H?介导的脱氮性能与DET机制分离。在实验中，所有反应器均在室温（20 ± 1°C）下运行，使用25毫米的搅拌棒在操作期间以约60 RPM的速度搅拌。此外，反应器中的阴极和阳极电极均进行了标准化处理，以确保实验的一致性。

### 接种物的来源与处理

实验中使用的接种物来源于新西兰奥克弗流的地下水流沉积物。通过钻取1.4升的沉积物样本，确保其含有足够的硝酸盐污染，同时提供一个适合研究的环境。在处理过程中，沉积物被稀释到无机碳的生长介质中，并通过过滤去除大颗粒。不同反应器的接种策略有所不同，其中BED1使用了氢营养型脱氮菌的富集，而BED2使用了生物过滤器（BTF）的生物膜。这些接种物经过预处理，以确保其适合用于实验。

### 增殖培养基的配置

为了模拟硝酸盐污染地下水中的碳限制条件，所有BED反应器均使用了“DMR增殖培养基”，该培养基明显不含有机碳。增殖培养基的配方基于Puig等人的原始配方进行调整。在阴极电极室中，培养基包含244 mg L?1的NaHCO?、1090 mg L?1的NaH?PO?·2H?O、480 mg L?1的KH?PO?·2H?O、2.8 mg L?1的CaCl?·2H?O、18 mg L?1的MgSO?·7H?O、2.6 mg L?1的KCl以及0.1 mL L?1的微量营养液。在阳极电极室中，NaH?PO?·2H?O和KH?PO?·2H?O的浓度被提高，以提供额外的缓冲能力，防止快速酸化和延缓电极降解。微量营养液的配方来源于Rabaey等人的研究，包括EDTA、FeSO?·7H?O、ZnCl?、MnCl?·4H?O、H?BO?、CaCl?·6H?O、CuCl?·2H?O、NiCl?·6H?O、Na?MoO?·2H?O和CoCl?·6H?O。所有化学物质均从Sigma-Aldrich（美国）获得，纯度大于97%，除非另有说明。在实验开始前，所有培养基均经过高压灭菌（121°C，15 psi，44分钟）处理。

### 反应器运行与非生物验证

BED反应器被操作为微生物电解池（MEC），需要使用模型1402恒电位仪来控制阴极电位。由于实验持续时间较长（超过7个月）以及实验设置的复杂性，重复反应器的使用并不现实，因此本研究更关注于多个平行反应器在不同处理条件下的运行。在初始的非生物实验中，阴极和阳极电极室均持续通入Ar:CO?（97:3 v/v；仪器级，BOC）气体，流量为7.5 ± 1.0 mL min?1。在接种前，每个BED反应器均被非生物操作约14天，以确认没有非生物（即电化学）的硝酸盐还原现象。

### 分批操作与连续进料实验

在接种后，所有BED反应器首先以分批操作模式运行，以促进生物膜的形成。在此期间，阴极和阳极电极室的液体体积均保持在500 mL。每个分批周期（如B1-B11）在硝酸盐耗尽后启动，通过向阴极室补充10 g NO??-N L?1的硝酸盐，以达到最终浓度约为38 mg NO??-N L?1。分批周期的持续时间根据每个反应器的性能在3到65天之间变化。在分批操作过程中，每天对阴极室的液体进行采样（1 mL），并用NO??自由的DMR培养基替换，以监测硝酸盐和亚硝酸盐浓度。采用改良的Griess试剂法进行分析，方法在后续部分进行了描述。

### 电流与电压测量

在实验中，工作电极（WE）电流通过数据记录器（USB5106 4-Channel Analog Data Logger，Measurement Computing Corporation，马萨诸塞州，美国）和电压电缆（CABLE-ADAP5，Onset Computer Corporation，马萨诸塞州，美国）进行连续测量。数据通过数据记录器（USB-5100系列，Measurement Computing Corporation，马萨诸塞州，美国）进行检索，并根据电位计上的电阻进行缩放。所有报告的电压值均基于相对于Ag/AgCl（饱和KCl；+0.197 V vs SHE）参考电极的电位测量。电位计的构建、校准和电流测量方法在补充材料中进行了描述。

### 硝酸盐和亚硝酸盐分析

在实验中，每天从阴极室采集1 mL的反应液样本，并在-18°C下保存，直到需要进行分析。对于硝酸盐和亚硝酸盐的定量，采用了一种两步的微体积（200 μL）分光光度法，基于García-Robledo等人的先前研究。具体来说，Griess试剂由1% w/v的磺胺（99%纯度，Sigma-Aldrich，美国）和1.2 M HCl等体积混合而成。对于亚硝酸盐的测定，将10 μL的Griess试剂加入到200 μL的样本中，并在室温下孵育20分钟。随后，在540 nm波长下使用Cytation 5（Biotek，美国）细胞板阅读器进行分析。对于硝酸盐的测定，将2% w/v的三氯化钒（97%纯度，Sigma-Aldrich，美国）溶液加入到210 μL的Griess试剂-样本混合物中，并在60°C下孵育25分钟。然后在540 nm波长下进行第二次分光光度测定。报告的数据点代表三次测量的平均值。

### 微生物DNA提取与测序

在连续进料实验完成后，从每个BED反应器的阴极表面采集生物膜，并用无菌的23G针（Becton, Dickinson and Company，美国）进行处理，并在-80°C下保存。每个反应器的接种物也以类似的方式采集和保存。随后，使用DNeasy UltraClean Microbial Kit（Qiagen，德国）根据制造商推荐的协议提取总基因组DNA。通过Nanodrop One分光光度计（Thermo Fisher Scientific，美国）评估DNA提取的质量。样品中260/280比值约为1.8，260/230比值大于1.8的视为可接受。如果这些比值低于规定范围，则进行额外的乙醇沉淀步骤以进一步纯化。纯化的DNA提取物随后使用Qubit? dsDNA High Sensitivity Quantification Assay Kit（Invitrogen?，Thermo Fisher Scientific，美国）进行测试，并用Qubit? 4 Fluorometer（Invitrogen?，Thermo Fisher Scientific，美国）进行量化，然后在-80°C下保存，直到需要进行DNA测序。

### 数据处理与分析

DNA提取物（>10 ng μL?1）被送往Massey Genome Service（Massey University，Palmerston North，新西兰）进行16S rRNA基因扩增子测序，以分析V3-V4高变区的微生物群落。使用双索引PCR引物来扩增V3-V4高变区。采用“Single Step PCR Library preparation method”（[39]）准备样本库。使用的引物序列为16Sf V3（CCTACGGGAGGCAGCAG）和16Sr V4（GGACTACHVGGGTWTCTAAT）（Integrated DNA Technologies，美国）。样本库在等摩尔和质量控制后进行合并，并使用MiSeq 2×250 base PE Nano运行，版本2化学（Illumina，美国）进行分析。为了防止在扩增子测序过程中每个循环的碱基分布不均，Illumina PhiX控制库在Illumina Miseq运行中以20%体积加载，以平衡碱基组成并防止碱基识别错误。

### 数据处理流程

处理后的序列数据使用BBduk进行分析，并在错误概率为0.01（Phred分数为Q20）时使用SolexaQA++软件的“dynamictrim”应用程序进行修剪。使用dada2程序（[101]）在RStudio（[41]）上对序列变异进行分类，并使用Silva 138.1数据库（[42]）进行微生物分类。用于绘制Bray-Curtis图的数据使用phyloseq包（[43]）在RStudio（[41]）上进行计算，并提取后使用GraphPad Prism版本10.1.2（GraphPad Software，美国）进行绘制。

### 统计分析

所有平均数据点均使用变异系数为0.2进行过滤。Pearson相关性分析和绘图均在GraphPad Prism版本10.1.2（GraphPad Software，美国）中进行。当双尾t检验的p值≤0.05时，相关性被视为显著。Welch t检验使用Microsoft Excel（Microsoft Corporation）进行。

### 结果与讨论

本研究旨在探讨不同阴极电位对硝酸盐去除速率以及电活性生物膜群落组成和机制的影响。硝酸盐污染的地下水通常缺乏可降解的有机碳，以维持异养型脱氮作用，已报道的溶解有机碳水平通常低于2 mg L?1（例如，[2]、[4]）。为了模拟这些电子供体受限的条件，实验中使用了较低的C/NO??比，从而评估阴极电位控制作为增强硝酸盐去除的策略。在初始的非生物实验中，未观察到电化学硝酸盐还原现象，但观察到阴极表面有气泡产生，这被认为是电化学H?生成的证据。类似的BESs（三电极、双室）在-947 mV（vs Ag/AgCl，[44]）时已报道过非生物H?生成（0.091 ± 0.004 L H? m?2 d?1）。在中性pH下，H?生成的热力学电位约为-0.62 V vs Ag/AgCl。因此，考虑到在石墨电极上通常的电化学过电位为0.2–0.3 V，只有在电位低于-0.8至-0.9 V vs Ag/AgCl时才会显著生成H?。因此，为了研究这些反应器中的DET和H?-MET性能，分别使用了-700 mV和-1100 mV的电位。

### 分批操作性能

在分批实验中，研究了每个BED反应器中控制脱氮的电子传输机制。在之前涉及Thiobacillus denitrificans、Geobacter metallireducens和Pseudomonas alcaliphila的“纯培养”分批研究中，电流与硝酸盐还原速率之间存在强相关性，表明DET机制的主导作用。因此，为了阐明在BED反应器中发生的电活性机制（如DET、H?-MET），将硝酸盐和亚硝酸盐去除速率与观察到的电流进行相关性分析。BED1的硝酸盐（和亚硝酸盐）去除速率与观察到的电流之间显示弱负相关性，表明DET不太可能发生，观察到的脱氮作用更可能是H?介导的。相比之下，BED2和BED3的硝酸盐（和亚硝酸盐）去除速率与观察到的电流之间显示出显著的正相关性。BED4（-700 mV）没有表现出电流与硝酸盐（或亚硝酸盐）去除速率之间的显著相关性。每个分批周期的平均硝酸盐还原速率被绘制出来，以促进脱氮性能的比较。

### 不同硝酸盐浓度下的去除性能评估

接下来，在连续流电活性脱氮系统中，通过改变硝酸盐的负荷率来评估硝酸盐去除性能。在低底物负荷率下，测试了整体电流密度和脱氮性能，使用硝酸盐浓度低于153 mg NO??-N L?1。大多数连续脱氮研究采用负荷率高于100 mg NO??-N L?1 d?1（[29]、[48]、[49]、[50]）。然而，由于本研究中使用的电极表面积（20.4 cm2）明显小于通常使用的情况，因此采用了较慢的硝酸盐负荷率（<100 mg NO??-N L?1 d?1，相当于11 g NO??-N m?2 d?1）进行初始实验。

### 生物膜DNA群落分析

在不同阴极电位和富集策略下，分析了阴极生物膜群落结构。Bray-Curtis分析表明，阴极电位对阴极生物膜微生物群落结构有显著影响。BED1-3均被富集用于已知的氢营养型脱氮菌属，包括Simplicispira、Hydrogenophaga和Dechloromonas。尽管Hydrogenophaga spp.在所有接种物中以低丰度（<0.5%）存在，但在-1100 mV下富集的沉积物中，其丰度增加到26.1%。Hydrogenophaga spp.的出现已被与氢营养型脱氮系统联系起来。相比之下，BED2主要由Simplicispira spp.（79.6%）主导，而Dechloromonas在BED1中最为丰富（25.7%）。Simplicispira spp.和Dechloromonas spp.的出现已在氢营养型脱氮系统中被报道。

### 氢营养型微生物的特性

氢营养型微生物依赖氢化酶，这是一种能够可逆催化质子还原为H?气体的金属酶家族。由于质子还原的标准电位为-410 mV vs SHE，电子必须转移到一个具有更低还原电位的能量载体（如NADPH，E° -320 mV vs SHE）以驱动氢气的产生。通常，这是通过铁氧还蛋白完成的，而铁氧还蛋白在所有生命领域中普遍存在，因此在这些电位下，这些微生物进行H?合成和氧化是热力学可行的。此前，通过阴极电位低于-797 mV富集Geobacter sulfurreducens的结果显示了催化生物电化学H?的产生。尽管没有研究报道Hydrogenophaga spp.的氢气产生，但对从Hydrogenophaga sp. AH-24中分离出的[NiFe]氢化酶的生化特性表明其具有H?氧化和生成能力。尽管氢营养型脱氮菌可能进行生物电化学H?的产生，但在这些生物膜中并未富集已知的电活性氢气生产者，如各种Clostridium菌种。然而，参与DET和H?-MET的微生物共存表明了这些机制可能协同增强BED2和BED3中观察到的硝酸盐去除速率。

### 异养型脱氮菌的特性

已知的异养型脱氮菌属在阴极生物膜中包括Flavobacterium和Thermomonas。Flavobacterium spp.广泛被认为是形成好氧颗粒和异养型脱氮能力的。Thermomonas spp.则已知能吸收溶于水的有机副产物，无论是由硝化菌分泌的还是由细胞分解产生的。考虑到这些反应器在没有有机碳补充的情况下连续运行超过7个月，跨物种的交叉喂养可能是这些菌属丰度的原因。

### 潜在的亚硝酸盐循环

Dokdonella和Candidatus Nitrotoga可能参与亚硝酸盐循环。Wang和Zhang报告了Dokdonella属中硝酸盐还原酶基因（nirS和nirK）的正相关性。虽然Dokdonella spp.已与好氧NOx还原相关，但该属也可能减少N?O。Ca. Nitrotoga是亚硝酸盐氧化菌属，被认为在工程和自然环境中在氮去除中起关键作用。最近对四种培养的Ca. Nitrotoga spp.的基因组分析识别出了一种新的周质亚硝酸盐氧化还原酶α亚基（NxrA），这可能根据亚硝酸盐氧化还原酶的氧化还原状态起可逆硝酸盐还原酶的作用。

### 电活性与脱氮机制

Ca. Nitrotoga在BED4中占主导地位（60.7%），该反应器在较低电位（即-700 ± 2 mV）下运行，以促进仅由DET驱动的脱氮生物膜的形成。考虑到BED4中已知的氢营养型脱氮菌丰度较低，可以推断氢营养型脱氮作用（NO??和NO??）在该反应器中可以忽略不计，而Ca. Nitrotoga可能贡献了观察到的电活性脱氮作用。Pous等此前报告了在处理硝酸盐污染的地下水时，电极生物膜主要由Ca. Nitrotoga spp.、Betaproteobacteria spp.和Thauera spp.主导。然而，目前还没有研究直接探讨Ca. Nitrotoga的电活性潜力，这可能是因为其在实验室环境中难以培养。

### 结论

本研究表明，阴极电位可以显著影响地下水系统中硝酸盐去除速率和电活性生物膜群落的组成。BED2和BED3在-1100 mV下运行，并显示硝酸盐去除速率与观察到的电流之间存在显著的正相关性。这可能表明这些电活性阴极生物膜使用了H?-MET和DET机制的组合。相比之下，BED1的脱氮作用主要由氢营养型途径驱动。BED4在低于电化学H?生成阈值（-700 mV）的电位下运行，并主要由Ca. Nitrotoga spp.主导，表明其具有DET能力。我们承认，我们对电活性和DET与H?-MET相对贡献的解释是基于多种间接证据，而未来的实验可以通过循环伏安法或直接的氢气定量分析进一步确认。此外，我们承认，没有有机碳补充的情况下，无法进行完整的氮平衡，包括气体中间体和生物膜中的有机氮的稳定测量。总体而言，本研究强调了优化阴极电位以提高脱氮性能的重要性，并提供了关于这些过程中涉及的生物膜群落结构的宝贵见解。