RGD修饰的葡聚糖甲基丙烯酸酯水凝胶搭载成骨肽和Mn3O4纳米酶通过免疫调节-成骨耦合策略促进骨缺损修复

本研究针对骨缺损修复过程中过度活性氧（ROS）引发的剧烈炎症破坏巨噬细胞与骨髓间充质干细胞（BMSCs）等组织再生细胞间通讯、延缓愈合进程的难题，构建了RGD@DEXMA/DOPA-P24/Mn3O4复合水凝胶。该水凝胶通过Mn3O4纳米酶清除ROS、诱导巨噬细胞M1向M2极化以调节免疫微环境，协同RGD序列促进细胞粘附增殖及DOPA-P24缓释诱导成骨分化，最终在体内显著加速骨缺损愈合，为骨组织工程提供了免疫调节与成骨协同的新策略。

　　

由感染、创伤、肿瘤等原因造成的骨缺损，其临床治疗至今仍是一项重大挑战。当缺损达到一定程度时，人体的自愈能力十分有限，这不仅严重影响患者的生理功能，更给其心理健康带来巨大危害。在骨缺损区域，过量的活性氧（ROS）积累会引发剧烈的氧化应激损伤和强烈的炎症反应。这种异常的微环境会破坏巨噬细胞与骨髓间充质干细胞（BMSCs）、血管内皮细胞等关键再生细胞之间的正常通讯，严重阻碍血管生成和成骨过程，从而延迟甚至中断愈合进程。因此，通过基于生物材料的策略来调控免疫微环境，对于实现有效的骨愈合至关重要。

近年来，骨组织工程（BTE）发展迅速，其中水凝胶因其高孔隙率、类似细胞外基质的结构以及良好的药物负载能力而备受关注。然而，传统的骨修复支架功能往往较为单一，要么侧重于成骨诱导，要么侧重于机械支撑，难以应对骨愈合过程中复杂的生物学过程，特别是免疫微环境的调控。理想的骨修复材料应能同时促进细胞行为（如粘附、增殖）、诱导成骨分化，并有效调节局部免疫反应，从而为骨再生创造有利条件。

为了攻克这一难题，吉林大学的研究团队在《Materials Today Bio》上发表了一项创新性研究，他们成功构建了一种多功能复合水凝胶体系（RGD@DEXMA/DOPA-P24/Mn₃O₄），旨在通过“免疫调节-成骨耦合”策略协同促进骨缺损愈合。该水凝胶以精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）序列修饰的葡聚糖甲基丙烯酸酯（DEXMA）为基质，共同负载了3,4-二羟基苯丙氨酸（DOPA）修饰的成骨肽P24（DOPA-P24）和锰氧化物（Mn₃O₄）纳米酶。

研究人员为开展此项研究，主要运用了以下几项关键技术方法：通过扫描电子显微镜（SEM）、傅里叶变换红外光谱（FTIR）、X射线衍射（XRD）和能谱分析（EDS）对材料进行形貌、结构和成分表征；通过体外降解实验和释放曲线测定评估水凝胶的降解性能及DOPA-P24、锰离子的释放行为；通过细胞计数试剂盒-8（CCK-8）实验、细胞活死染色、细胞骨架染色和溶血实验系统评估了水凝胶对巨噬细胞（RAW 264.7细胞）和大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）的细胞相容性、粘附及增殖影响；通过羟基自由基（•OH）和1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）清除实验、二氢乙锭（DHE）染色和2‘,7’-二氯二氢荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）染色及流式细胞术，评估了材料的抗氧化应激能力；通过免疫荧光染色、实时定量聚合酶链反应（RT-qPCR）评估了材料对脂多糖（LPS）诱导的巨噬细胞极化（CD86/CD206标志物）及相关炎症因子（TNF-α, IL-1β, TGF-β, IL-10）表达的影响；通过Transwell实验、体外成管实验评估巨噬细胞条件培养基（MCM）对人脐静脉内皮细胞（HUVECs）血管生成的影响；通过碱性磷酸酶（ALP）活性分析、茜素红S（ARS）染色、RT-qPCR和蛋白质印迹（WB）评估了材料对BMSCs成骨分化的影响；最后，通过建立大鼠颅骨临界缺损模型，利用微型电子计算机断层扫描（Micro-CT）、苏木精-伊红（H&E）染色、Masson染色、免疫组织化学染色和免疫荧光染色，在体内综合评价了水凝胶的骨缺损修复效果及相关因子（TNF-α, IL-10, VEGF, CD31, OCN）的表达。

3.1. RGD@DEXMA/DOPA-P24/Mn₃O₄水凝胶的合成与表征

研究人员通过405纳米紫外光照射DEXMA溶液30秒成功合成了水凝胶。扫描电镜显示水凝胶具有多孔结构，平均孔径为96.8 ± 21.8微米，有利于细胞粘附。傅里叶变换红外光谱证实了RGD的成功接枝以及DOPA-P24和Mn₃O₄的成功负载。元素面分布分析显示了碳、氮、氧、磷、锰元素的均匀分布，证实了功能组分的共存。X射线衍射分析确认了Mn₃O₄纳米酶为四方晶系结构。释放实验表明，DOPA修饰的P24（DOPA-P24）相较于未修饰的P24，从水凝胶中的释放行为更为缓慢持续，有利于长效成骨诱导。降解实验显示水凝胶在21天内可降解约85%。力学性能测试表明，RGD修饰以及Mn₃O₄的加入提升了水凝胶的压缩强度和模量。

3.2. 生物相容性评估

通过细胞活死染色、CCK-8实验和溶血实验，确定了DOPA-P24和Mn₃O₄的安全工作浓度分别为200 μg/mL和100 μg/mL，并证实所有水凝胶均具有良好的生物相容性。细胞骨架染色和CCK-8实验进一步表明，RGD序列的引入显著促进了BMSCs的粘附和铺展，而含有DOPA-P24的水凝胶（RGD@DEXMA/DOPA-P24和RGD@DEXMA/DOPA-P24/Mn₃O₄）则进一步增强了BMSCs的粘附面积和代谢活性，表明RGD和DOPA-P24在促进细胞行为方面具有协同作用。

3.3. 抗氧化应激损伤性能评估

通过•OH和DPPH自由基清除实验发现，RGD@DEXMA/DOPA-P24/Mn₃O₄水凝胶表现出最高的自由基清除率（超过70%），这主要归功于Mn₃O₄纳米酶通过Mn²⁺/Mn³⁺氧化还原循环模拟过氧化氢酶（CAT）和超氧化物歧化酶（SOD）活性，以及DOPA部分中儿茶酚基团的抗氧化能力。在过氧化氢（H₂O₂）诱导的RAW 264.7巨噬细胞模型中，DHE染色和DCFH-DA染色（包括流式细胞术分析）均显示，该复合水凝胶能有效降低细胞内ROS水平，表明其具有显著的减轻氧化应激损伤的潜力。

3.4. 体外免疫调节特性评估

为了评估水凝胶的免疫调节能力，研究人员检测了脂多糖（LPS）诱导的巨噬细胞表型极化。免疫荧光染色显示，与其它组相比，RGD@DEXMA/DOPA-P24/Mn₃O₄水凝胶处理的巨噬细胞，其促炎M1型标志物CD86的表达面积显著降低，而抗炎M2型标志物CD206的表达则显著增加。RT-qPCR结果一致表明，该水凝胶能显著下调M1型相关基因（TNF-α, IL-1β）的表达，同时上调M2型相关基因（TGF-β, IL-10）的表达。此外，该水凝胶还能显著下调缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）的表达，这可能是通过清除ROS、改善缺氧微环境来实现的。这些结果证实了Mn₃O₄纳米酶能有效诱导巨噬细胞向M2型极化，从而缓解炎症。

3.5. 通过免疫调节增强血管生成和成骨作用

研究进一步探讨了免疫调节对血管生成和成骨的影响。Transwell实验和体外成管实验表明，用RGD@DEXMA/DOPA-P24/Mn₃O₄组巨噬细胞的条件培养基（MCM）处理人脐静脉内皮细胞（HUVECs）后，HUVECs的迁移能力和形成管状结构的能力（节点数）均最强，提示M2型巨噬细胞分泌的血管内皮生长因子（VEGF）等因子促进了血管生成。在成骨方面，ALP染色、ARS染色以及RT-qPCR和WB分析显示，该复合水凝胶处理组的BMSCs表现出最高的ALP活性、钙结节形成量以及成骨相关基因（RUNX-2, ALP, OCN, COL-I）和蛋白（RUNX-2, COL1a1）的表达水平。这表明由免疫调节创造的有利微环境与DOPA-P24的成骨诱导作用协同增强了BMSCs的成骨分化。

3.6. 体内对骨缺损的治疗效果

在大鼠颅骨临界缺损模型中植入水凝胶8周后，Micro-CT三维重建和骨体积分数（BV/TV）分析显示，RGD@DEXMA/DOPA-P24/Mn₃O₄组的新骨形成量显著多于其他各组。H&E染色和Masson染色进一步证实，该组缺损处有大量新骨形成，胶原沉积丰富，骨小梁数量（Tb.N）和厚度（Tb.Th）也显著增加，接近假手术组水平。主要器官H&E染色和体内锰离子残留量检测表明Mn₃O₄纳米酶具有良好的生物安全性和代谢特性。

3.7. 体内炎症和组织再生相关细胞因子表达

免疫组织化学染色显示，RGD@DEXMA/DOPA-P24/Mn₃O₄水凝胶植入部位促炎因子TNF-α的阳性表达面积显著降低约80%，而抗炎因子IL-10的表达则增加了约400%，证实了其有效的体内免疫调节能力。免疫荧光染色表明，该水凝胶处理组的缺损区域血管生成标志物VEGF和CD31、以及成骨标志物OCN的表达均显著上调，与体外实验结果相互印证，说明其通过免疫调节协同促进了血管生成和成骨过程。

本研究成功构建了一种集细胞粘附增殖、成骨诱导和免疫调节多功能于一体的RGD@DEXMA/DOPA-P24/Mn₃O₄复合水凝胶。该水凝胶通过RGD序列和DOPA-P24协同促进BMSCs的粘附、增殖和成骨分化，并通过Mn₃O₄纳米酶有效清除ROS、诱导巨噬细胞M2型极化，从而改善缺损局部的免疫微环境，进而增强血管生成，最终在体内显著加速骨缺损愈合。这项工作揭示了通过“免疫调节-成骨耦合”策略促进骨再生的新途径，为开发下一代多功能骨组织工程支架提供了有前景的策略。尽管在走向临床转化的道路上仍面临大规模制备、成本控制等挑战，但本研究为解决复杂骨缺损修复难题提供了新的思路和实验依据。