全面绘制人源独立假尿苷合成酶依赖性tRNA假尿苷修饰图谱揭示其在pre-tRNA加工过程中的时序调控

《Nature Cell Biology》：A comprehensive tRNA pseudouridine map uncovers targets dependent on human stand-alone pseudouridine synthases

本刊推荐：为阐明人源独立假尿苷合成酶(PUS)的底物特异性及功能，研究人员利用2-溴丙烯酰胺辅助环化测序(BACS)技术，系统性敲除/敲低了9个独立PUS，绘制了全面的Ψ修饰图谱。研究揭示了RPUSD1/2、PUS3、PUSL1和PUS7L的新靶点，发现TRUB1与PUS10在胞质tRNA(cy-tRNA)Ψ55修饰中存在功能冗余，并证实RPUSD3与TRUB2在体内无显著酶活。该图谱进一步揭示了不同PUS在pre-tRNA加工不同阶段引入Ψ修饰的时序规律，为理解Ψ修饰的生物学功能提供了重要资源。

　　

在人类细胞的RNA修饰世界中，假尿苷(Ψ)是最丰富、也是最神秘的修饰之一。这种由假尿苷合成酶(PUS)催化产生的修饰，广泛存在于核糖体RNA(rRNA)、小核RNA(snRNA)和转移RNA(tRNA)等非编码RNA中，在翻译、剪接和RNA稳定性调控中扮演关键角色。尽管科学家们已经知道Ψ的重要性超过70年，但对其具体生物学功能的理解却进展缓慢，这主要源于我们对特定PUS酶与其靶点之间关联的认识有限。

人类基因组中注释有13种PUS酶，它们与多种遗传疾病和癌症相关。然而，除了少数几个从细菌和酵母中同源物研究较多的酶(如TRUB1、PUS7和PUS1)外，其他9种独立PUS酶的靶点和功能大多未知。传统Ψ检测方法如N-环己基-N'-(2-吗啉乙基)碳二亚胺甲基-对甲苯磺酸盐(CMC)化学法存在背景噪声高、单碱基分辨率定位困难、难以定量化学计量以及无法检测密集修饰位点等局限性。

为了突破这些技术瓶颈，牛津大学Ludwig癌症研究所的Chun-Xiao Song团队最近开发了2-溴丙烯酰胺辅助环化测序(BACS)技术，能够通过诱导Ψ-to-C突变，实现Ψ的直接、定量和碱基分辨率测序。与传统方法相比，BACS在灵敏度、背景噪声、位点确定精确度、化学计量定量准确性以及密集Ψ位点检测稳健性方面均表现出色。

在这项发表于《Nature Cell Biology》的最新研究中，研究人员旨在构建一个全面的人源独立PUS依赖性Ψ修饰图谱。他们在HCT116结直肠癌细胞中分别敲除了7个PUS酶(PUS3、PUS7L、PUSL1和RPUSD1-3)并敲低了2个PUS酶(RPUSD4和TRUB2)，然后使用BACS技术检测非编码RNA中的Ψ修饰情况。

通过比较野生型细胞的结果，研究团队取得了多项重要发现。RPUSD1和RPUSD2负责tRNA中几个先前未知的Ψ靶点：RPUSD1催化cy-tRNA中Ψ30和Ψ72的形成，而RPUSD2则在cy-tRNA和线粒体tRNA(mt-tRNA)中安装Ψ31-32修饰，并在cy-tRNA中修饰反密码子位置Ψ34。这两种酶还展现出截然不同的序列偏好性。

特别有趣的是，研究人员发现TRUB1和PUS10在cy-tRNA Ψ55修饰中存在功能冗余。虽然TRUB1是这一修饰的主要负责酶，但PUS10也参与其中，两者协同工作而非严格区分于不同的tRNA亚群。相比之下，TRUB2虽然在序列上与TRUB1相似，但在体内并未表现出显著的PUS酶活性，可能已进化出其他功能。

在研究PUS3和PUSL1时，团队发现它们的活性存在细胞区室化分工。PUS3的活性仅限于cy-tRNA中的Ψ38-40修饰，而主要定位于线粒体的PUSL1则负责mt-tRNA中相应位置的修饰。这一发现为理解PUSL1在线粒体翻译中的必需性提供了可能解释。

最令人惊讶的发现来自PUS7L，这个与PUS7同源但功能长期未知的酶。研究表明，PUS7L在cy-tRNA可变环内具有独特的催化活性，修饰Ψe12和Ψe1位点，与PUS7的底物偏好性形成鲜明对比。

通过整合这些结果与之前关于TRUB1、PUS7和PUS1的数据，研究人员成功构建了全面的人源PUS依赖性tRNA Ψ修饰图谱。与大肠杆菌和酿酒酵母的图谱相比，人类细胞tRNA中含有更多丰富的Ψ位点，相应的PUS酶也展现出更多样化的活性。

利用这一全面图谱，团队进一步研究了不同PUS酶在pre-tRNA加工过程中引入Ψ修饰的具体阶段。他们发现，含内含子的pre-tRNA中存在多个内含子敏感的Ψ位点，特别是那些靠近内含子的位置，如RPUSD1依赖的Ψ30和PUS3依赖的Ψ38-40。相反，反密码子Ψ34/35/36位点都在内含子剪接前被引入。值得注意的是，尽管酵母和人类细胞中这三个反密码子位置都能被修饰，但负责这些修饰事件的酶却不同。

对于不含内含子的pre-tRNA(占人类细胞pre-tRNA的大多数)，研究证实PUS7依赖的Ψ13和Ψ20B位点以及TRUB1依赖的Ψ55位点分别在5‘-前导序列和3’-尾部序列修剪前就被高度修饰。然而，PUS10依赖的Ψ55位点在3‘-尾部序列移除前并未完全修饰，Ψ54位点也仅部分修饰。这些发现表明，不同PUS酶在pre-tRNA加工的不同阶段引入Ψ修饰，具有明显的时序规律。

研究采用的关键技术方法包括：利用CRISPR-Cas9技术在HCT116结直肠癌细胞中生成PUS酶敲除单克隆细胞系；使用短发夹RNA在HCT116和HeLa细胞中实现TRUB2敲低；通过2-溴丙烯酰胺辅助环化测序(BACS)技术进行Ψ检测；应用Western blot验证蛋白敲除/敲低效率；对pre-tRNA修饰分析采用严格过滤，保留覆盖5‘-前导、3’-尾部或内含子序列的读数。

研究结果部分通过多个图表系统展示：RPUSD1-4酶活表征显示RPUSD1和RPUSD2具有不同的tRNA靶点和序列 motif，RPUSD4负责16S mt-rRNA Ψ1397修饰，而RPUSD3无显著酶活；TRUB1和PUS10功能冗余分析揭示两者共同负责cy-tRNA Ψ55修饰，但具有不同的序列偏好性；PUS3和PUSL1区室化活性研究表明PUS3负责cy-tRNA Ψ38-40，PUSL1负责mt-tRNA相应位点；PUS7L独特催化活性发现其在cy-tRNA可变环内修饰Ψe12和Ψe1位点；全面PUS依赖性Ψ图谱构建显示人源tRNA修饰比细菌和酵母更复杂；pre-tRNA加工阶段研究发现不同PUS酶在不同时间点引入Ψ修饰。

研究结论强调，人源独立PUS酶在进化过程中活性显著扩展，比其细菌和酵母同源物具有更多样化的功能。PUS酶的靶点主要由两个因素决定：酶的亚细胞定位和其偏好性Ψ识别 motif。不同物种间相同Ψ位点由不同PUS酶修饰的现象，可以通过内含子序列和二级结构差异来解释。该研究提供的全面PUS依赖性Ψ图谱为研究其他关键模式生物(如秀丽隐杆线虫、果斑和斑马鱼)中的PUS酶提供了宝贵资源，有望推动Ψ修饰生物学功能的进一步阐明。