基于环境DNA多重PCR测序的水生入侵物种高效监测技术开发与应用

《Metabarcoding & Metagenomics》：?Invasive species monitoring based on eDNA multiplex PCR sequencing

为解决传统监测方法效率低、成本高的问题，本研究开发了基于eDNA多重PCR（mPCR）结合高通量测序的新型水生入侵物种监测技术。通过设计91对物种特异性引物，在珠江流域成功检测到28种入侵物种，显示高灵敏度与广泛应用潜力，为大规模生态监测提供关键技术支撑。

随着全球化进程加速和人类活动日益频繁，外来物种入侵已成为威胁全球生物多样性和生态系统稳定的重要因素。水生生态系统因其开放性和连通性特点，更易被入侵物种占据并引发连锁生态反应。例如原产南美的凤眼莲（Eichhornia crassipes）能快速形成密集漂浮层，阻断阳光并消耗水中氧气，导致本地水生植被衰退。传统监测方法主要依赖形态学鉴定（如肉眼观察、渔网捕捞），虽直观可靠，但存在流程繁琐、耗时长、物种分辨率低等局限，且电捕鱼等操作可能对水体环境造成二次伤害。

近年来，环境DNA（environmental DNA, eDNA）技术通过检测水体或土壤中的生物DNA片段，为物种监测提供了新思路。其中，代谢条形码（metabarcoding）利用通用引物扩增DNA片段并进行高通量测序，可大规模筛查物种组成。然而，该方法对稀有物种检测灵敏度不足，且易受非目标扩增干扰。物种特异性检测技术如qPCR（定量PCR）和ddPCR（微滴式数字PCR）虽灵敏度高，但一次仅能检测少数物种，难以满足大规模监测需求。此外，早期入侵阶段物种的eDNA浓度极低，常需嵌套PCR或昂贵设备支持，而水生生物数据库的完整性不足也制约了鉴定准确性。

为突破上述技术瓶颈，南京师范大学的研究团队在《Metabarcoding》发表论文，提出将多重PCR（multiplex PCR, mPCR）与高通量测序结合，开发了一种高效、低成本的水生入侵物种监测方案。该研究针对中国46种重点水生入侵物种，整合设计了91对特异性引物，可在单一PCR体系中同步扩增多个目标物种，并通过珠江流域实地应用验证其可靠性。

关键技术方法包括：

1. 1.
   引物设计与验证：从线粒体基因组（如COI、D-loop区）设计60对新引物，结合文献收录的31对引物，共91对引物均通过组织DNA验证；
2. 2.
   标准质粒构建：将各物种PCR产物克隆至pMD-19T载体，构建混合质粒库用于mPCR体系优化；
3. 3.
   野外采样与eDNA提取：在珠江流域32个站点采集水样，过滤后提取eDNA；
4. 4.
   mPCR扩增与测序：使用混合引物体系同步扩增eDNA，建库后通过Ion Torrent S5平台测序；
5. 5.
   生物信息学分析：利用QIIME、USEARCH等工具处理序列，以97%相似度聚类OTU，并通过BLAST比对物种注释。

混合标准质粒的mPCR扩增验证

在91对引物中，70对（包括55对新设计引物和15对文献引物）在mPCR体系中成功扩增，物种检测率达90%。扩增产物长度集中于150 bp左右，引物退火温度多在65°C附近。5种物种（如福寿螺、大鳄龟等）未检出，可能与引物间相互作用或高丰度非目标DNA竞争有关。

珠江口入侵物种的mPCR监测

应用mPCR在环境样本中检出28种入侵物种，其中入侵无脊椎动物纹藤壶（Amphibalanus amphitrite） 相对丰度最高。COI区域引物占比69.7%，D-loop区域引物（均为鱼类）占21.2%。站点L2、L3、L10等检出物种数超过22种，且河口区与内陆流域的物种组成差异显著：纹藤壶在河口站点（如L26、L27）占绝对优势，而尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus） 在内陆站点（如L3、L13）丰度较高，符合其生态分布特征。

mPCR与代谢条形码的比较

12S rRNA代谢条形码检出91种鱼类（含11种入侵鱼），全部被mPCR覆盖。mPCR额外检出17种非鱼类入侵物种（如甲壳类、软体动物），凸显其广谱性。两种方法对高丰度物种（如齐氏罗非鱼、尼罗罗非鱼）的检出量显著正相关（R² > 0.75，p < 0.01），但对低丰度物种（如豹纹翼甲鲶）的检测一致性较低，可能与代谢条形码的扩增偏好性有关。

讨论与生态意义

mPCR技术通过物种特异性引物克服了代谢条形码对非目标类群的检测盲区，且所需测序深度更低、成本更具优势。研究发现珠江流域罗非鱼（如奥利亚罗非鱼、尼罗罗非鱼）为优势入侵种，其高丰度分布区（如站点L34）建议优先采取生态拦截措施。纹藤壶的广泛分布可能与其附着船舶传播的特性相关。此外，研究提示eDNA检测结果在序列数较高时更可靠，为未来优化低丰度物种监测提供方向。

该研究建立的mPCR监测体系不仅提升了入侵物种早期预警能力，还可扩展至珍稀物种保护性监测，为全球生物多样性保护提供关键技术支持。其高效、低成本的特点尤其适合大规模常态化监测，有望成为生态管理决策的重要工具。