恩尼汀与脱氧雪腐镰刀菌烯醇在赤霉病主要病原体种间生长竞争中的体外作用机制研究

《Microbiological Research》：Role of enniatins and deoxynivalenol in interspecific growth and competition in vitro among the principal causal agents of Fusarium head blight

本研究针对赤霉病(FHB)病原菌在单一寄主上共存导致多种次级代谢产物累积的问题，通过体外实验探讨了恩尼汀(ENNs)和脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)对四种镰刀菌生长、代谢及竞争的影响。研究发现ENB+DON组合对所有菌株生长抑制最强，并诱导了禾谷镰刀菌(F. graminearum)应激反应基因上调及毒素合成基因激活。双培养实验表明毒素产生能力不影响种间竞争结果。该研究为解析镰刀菌生态位竞争机制及毒素协同作用提供了新视角。

　　

赤霉病（Fusarium Head Blight, FHB）是威胁全球谷物生产的重大病害，不仅造成作物减产，更因其病原菌产生的霉菌毒素污染粮食而危及人畜健康。禾谷镰刀菌（Fusarium graminearum）作为FHB的优势病原菌，能够产生强毒性的脱氧雪腐镰刀菌烯醇（Deoxynivalenol, DON），而来自镰刀菌 Tricinctum 物种复合群（FTSC）的木贼镰刀菌（Fusarium avenaceum）则是恩尼汀（Enniatins, ENNs）的主要生产者。在田间条件下，这些镰刀菌物种常共存于同一麦穗，导致DON与ENNs等多种毒素共同污染。然而，这些次级代谢产物如何影响病原菌自身的生长发育，以及它们在种间竞争中所扮演的角色，至今尚不明确。发表于《Microbiological Research》的这项研究，通过一系列体外实验，首次系统揭示了ENB（恩尼汀B）与DON单独及联合使用对四种主要FHB病原菌生长的抑制效应，并从分子层面解析了其作用机制，为理解镰刀菌种间互作及毒素的生态功能提供了重要线索。

为探究ENB与DON的生物学效应，研究团队采用了以下关键技术方法：利用马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基进行真菌生长抑制实验，评估不同浓度（10、50、100 mg L^-1）的ENB、DON及其组合对禾谷镰刀菌、木贼镰刀菌、黄色镰刀菌（F. culmorum）和梨孢镰刀菌（F. poae）菌丝扩展的影响；通过实时荧光定量PCR（RT-qPCR）技术分析禾谷镰刀菌在毒素胁迫下应激反应基因（FgHSP30、FgZPR1）、生长相关基因（FgIPAD、FgTDC）及毒素合成基因（FgTRI5、FgTRI6）的表达变化；运用液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）检测禾谷镰刀菌（野生型FgWT及其TRI5缺失突变体FgΔtri5）和木贼镰刀菌（野生型FaWT、ESYN1缺失突变体FaΔesyn1及其过表达株系FaESYN1_OX）在PDA和米粉琼脂（RFA）两种培养基上的次级代谢产物谱；并通过双培养实验，在两种培养基上比较野生型与基因工程菌株的竞争能力。实验所用菌株来源包括意大利本土分离株及加拿大、澳大利亚的菌种（如DAOM242378、CS3005）。

3.1. ENB与DON联合应用对四种镰刀菌均产生抑制作用

研究显示，ENB与DON单独作用时，仅在高浓度（100 mg L^-1）下对部分菌株（如黄色镰刀菌）生长有显著抑制。然而，当两者联合使用时，即使最低浓度（10 mg L^-1）也能显著抑制禾谷镰刀菌（5%）和木贼镰刀菌（14%）的生长。在最高浓度下，ENB+DON组合对所有测试菌株均表现出最强的抑制效果，其中对禾谷镰刀菌和木贼镰刀菌的抑制率分别达25%和21%。此外，毒素处理还引起菌落边缘色素沉着变化，提示代谢状态改变。

3.2. ENB、DON及其组合调控禾谷镰刀菌应激反应、生长及毒素合成相关基因表达

基因表达分析发现，100 mg L^-1的ENB、DON及其组合均能诱导禾谷镰刀菌应激反应基因FgHSP30（热休克蛋白）和FgZPR1（锌指蛋白）显著上调。其中ENB单独处理使FgZPR1表达升高30倍以上，而ENB+DON组合对FgHSP30的上调幅度（约2倍）低于单独处理（约5倍）。相反，生长相关基因FgIPAD（吲哚-3-丙酮酸脱羧酶）和FgTDC（色氨酸脱羧酶）的表达在所有毒素处理下均显著下调，尤以ENB+DON对FgIPAD的抑制最为明显（下降约80%）。值得注意的是，仅ENB+DON组合能强烈激活毒素合成基因FgTRI5（ trichodiene合酶）和FgTRI6（转录调控因子），表达量分别提升6.5倍和7.5倍，提示两种毒素协同作用可能通过应激通路触发毒素生物合成。

3.3. PDA与RFA培养基均支持禾谷镰刀菌与木贼镰刀菌产毒

LC-MS/MS分析证实，禾谷镰刀菌野生型FgWT在PDA和RFA上均能产生DON及其衍生物15-ADON，总量无显著差异；而木贼镰刀菌野生型FaWT及过表达株系FaESYN1_OX在PDA上产生的ENNs总量（303 mg g^-1）显著高于RFA（134 mg g^-1）。其他次级代谢物如aurofusarin、fusarin C等也在PDA中积累更高，表明培养基成分对代谢物合成有重要影响。

3.4. 镰刀菌种间竞争结果不依赖于ENNs或DON的产生

双培养实验表明，禾谷镰刀菌所有菌株（包括DON缺陷突变体FgΔtri5）在与木贼镰刀菌（包括ENNs缺陷突变体FaΔesyn1及过表达株系）共培养时，均表现出生长优势；而木贼镰刀菌的生长则受到显著抑制。这种竞争格局在PDA和RFA上一致，且不因菌株产毒能力改变而逆转，说明菌株间生长速率差异是竞争结果的主要决定因素，而非ENNs或DON的拮抗作用。

研究结论指出，ENB与DON的协同效应显著抑制镰刀菌生长，并通过激活应激反应与毒素合成通路影响禾谷镰刀菌代谢稳态。然而，在模拟自然竞争的实验中，毒素产生并未直接调控种间互作结局。这一发现修正了此前关于ENNs可能介导竞争的优势假说，强调环境毒素浓度与病原菌内在生长特性共同塑造田间菌群动态。该研究不仅为镰刀菌毒素的生态学功能提供了分子证据，也为开发基于毒素互作的新型病害防控策略奠定了理论基础。