基于微量血清的快速可重复LC-HRMS脂质组学与代谢组学整合分析新方法及其在年龄相关性黄斑变性研究中的应用

《Microchemical Journal》：Rapid and reproducible LC-HRMS for combined lipidomics and metabolomics from minimal serum volumes: application to age-related macular degeneration

本研究针对临床脂质组学和代谢组学分析对高灵敏度、高覆盖度、高重复性及微量样本兼容性的迫切需求，开发了一种仅需10 μL血清的集成化LC-HRMS工作流程。研究人员采用简化的甲醇/甲基叔丁基醚(1:1, v/v)提取方案，结合商用内标和半自动化数据处理脚本，实现了脂质与（半）极性代谢物的同步分析。该方法成功鉴定了23类440多种脂质，内标归一化后分析精密度显著提升（RSD 5-6%），并在AMD临床队列中揭示了包括高度不饱和甘油三酯(TG 22:6_22:6_22:6)34倍上调在内的显著代谢改变，为生物标志物发现和精准医疗提供了强有力的技术平台。

　　

在当今生命科学和临床医学研究领域，对生物体内小分子化合物的全面分析正变得愈发重要。脂质和代谢物作为生命活动的关键执行者，其动态变化与众多疾病的发生发展密切相关。年龄相关性黄斑变性(AMD)作为一种常见的致盲性眼病，其发病机制复杂，涉及全身性代谢紊乱。然而，传统的脂质组学和代谢组学分析通常需要分别进行，这不仅消耗大量珍贵样本，还增加了操作复杂性和分析时间，在临床样本有限的情况下尤为不便。

为了解决这些挑战，来自西班牙阿斯图里亚斯乳制品研究所-高等科学研究理事会(IPLA-CSIC)的Clara de Lorenzo、Héctor González-Iglesias等研究人员在《Microchemical Journal》上发表了一项创新性工作，他们开发了一种高效、可重复的液相色谱-高分辨质谱(LC-HRMS)工作流程，能够从微量血清样本中同步进行脂质组学和代谢组学分析。这项研究不仅优化了实验方法，还将其成功应用于AMD临床队列，揭示了疾病相关的特异性代谢改变。

研究人员采用了几项关键技术方法：首先优化了脂质/代谢物提取方案，比较了四种提取方法后确定甲醇/甲基叔丁基醚(MTBE)(1:1, v/v)单相提取法最优；使用Agilent 6560B离子淌度四极杆飞行时间质谱(IM-QTOF-MS)进行分析；利用Lipid Annotator软件和LipidBlast数据库进行脂质鉴定；开发了名为Lipidomic_Normalizer的Python脚本进行半自动化数据处理和归一化；研究纳入了40名参与者（20名干性AMD患者和20名年龄性别匹配的健康对照）的血清样本。

3.1. 脂质和代谢物提取方案

研究人员比较了四种提取方案，发现甲醇/MTBE(1:1)单相提取法(提取2)在脂质覆盖度和重现性方面表现最佳，可鉴定337种脂质(RSD 9%)和408种代谢物(RSD 13%)。该方法简化了操作流程，减少了技术变异，特别适合临床高通量应用。

3.2. 通过迭代串联质谱分析人血清样本的脂质组成

应用优化后的提取方案对临床样本进行分析，通过正负离子模式共鉴定出440种高置信度脂质，涵盖23个脂质家族。正离子模式以甘油三酯(TG, 50.4%)和磷脂酰胆碱(PC, 24.5%)为主，负离子模式则检测到更多极性脂质，展现了互补的脂质组覆盖能力。

3.3. 通过LC-MS对人血清样品进行半定量脂质组学分析

3.3.1. 归一化内标的选择

研究人员评估了同位素标记脂质标准品，最终选择7种（正离子模式）和8种（负离子模式）重现性良好的内标进行归一化，其相对标准偏差(RSD)在2-14%之间。

3.3.2. 人血清脂质组学的归一化策略

比较三种归一化方法（未归一化、总离子丰度归一化、内标归一化）后发现，内标归一化能显著提高数据质量，使QC样本在PCA图中紧密聚类，并将脂质丰度的平均RSD从12%（未归一化）降至6%（正离子模式）和从9%降至5%（负离子模式）。

3.3.3. 脂质组学归一化脚本

自主研发的Lipidomic_Normalizer脚本将数据处理时间从3-5小时缩短至10分钟以内，实现了脂质家族特异性归一化和重复条目自动处理，提高了数据分析的效率和可靠性。

3.4. AMD患者与对照血清的脂质组学比较分析

应用内标归一化方法分析AMD队列，发现TG 22:6_22:6_22:6（含DHA的高度不饱和甘油三酯）显著上调34倍，而其他TG物种、游离脂肪酸（如FA 18:2、FA 18:1）、羟基脂肪酸(FAHFA)和鞘磷脂(SM)则显著降低，表明AMD患者存在明显的脂质代谢重塑。

3.5. 通过LC-MS对人血清样品进行代谢组学分析

代谢组学分析揭示了AMD患者与对照之间的差异，正离子模式中发现23种代谢物存在显著差异，包括(E)-9-十八碳烯酸甲酯和KDN连接的糖鞘脂等，提示AMD涉及全身性代谢重组。

这项研究建立的工作流程成功解决了临床脂质组学和代谢组学分析中的多个关键问题。该方法仅需10 μL血清，通过简化的提取方案和自动化数据处理，实现了脂质与代谢物的同步分析，大大提高了分析效率和重现性。在AMD临床应用中发现的特异性脂质和代谢物改变，不仅为理解疾病机制提供了新视角，也为生物标志物发现和精准医疗提供了实用平台。该方法可轻松适应其他生物基质和疾病类型，在营养学研究、疾病机制探索和临床诊断领域具有广泛的应用前景。