RNA m6A通过表观转录组与表观基因组交叉调控拟南芥逆转录转座子转录及异染色质状态

《Nature Plants》：RNA m6A regulates the transcription and heterochromatin state of retrotransposons in Arabidopsis

本研究揭示了拟南芥中RNA m6A修饰通过核内阅读器蛋白CPSF30-L/ECT12识别，招募组蛋白甲基转移酶SUVH4/5/6和ATXR5/6，促进异染色质标记H3K9me2/H3K27me1沉积，从而抑制逆转录转座子转录的新机制。该发现阐明了植物中表观转录组与表观基因组协同调控基因组稳定性的重要途径，为作物遗传改良提供了新思路。

　　

在植物基因组中，逆转录转座子如同沉睡的巨人，占据了基因组相当大的比例。这些可移动的DNA元件一旦被激活，可能会跳转到基因组的新位置，引起基因突变，破坏基因功能，甚至导致基因组不稳定。因此，细胞进化出了精细的调控机制来让这些"基因组寄生虫"保持沉默。其中，表观遗传调控，如DNA甲基化和组蛋白修饰，被证明在抑制转座子活性中发挥关键作用。

然而，科学家们最近发现，除了DNA和组蛋白层面的表观修饰，RNA本身也携带着丰富的化学修饰信息，这些修饰构成了"表观转录组"。在众多RNA修饰中，N6-甲基腺嘌呤（m⁶A）是最常见的一种，它在mRNA和非编码RNA中广泛存在。在哺乳动物中的研究表明，m⁶A可以影响染色质状态和基因转录，特别是在调控逆转录转座子方面发挥着重要作用。但是，在植物中，m⁶A是否以及如何参与逆转录转座子的转录调控和染色质状态维持，一直是个未解之谜。

植物与哺乳动物在异染色质标记上存在显著差异：植物主要使用组蛋白H3K9二甲基化（H3K9me2）和H3K27单甲基化（H3K27me1）作为异染色质标记，而哺乳动物则主要依赖H3K9三甲基化（H3K9me3）。这种差异使得植物中m⁶A的调控机制可能具有独特性。

为了解决这一科学问题，北京大学贾桂芳研究员团队在《Nature Plants》上发表了他们的最新研究成果。他们开发了适用于植物的染色质相关RNA（caRNA）m⁶A测序技术，系统描绘了拟南芥中逆转录转座子RNA的m⁶A修饰图谱，并深入解析了m⁶A通过阅读器蛋白CPSF30-L和ECT12调控组蛋白修饰和异染色质形成的分子机制。

研究人员首先优化了适用于植物染色质相关RNA的m⁶A测序方法（caRNA m⁶A-Seq），该方法能够高效分离无DNA污染且无核糖体RNA污染的caRNA，然后进行m⁶A免疫共沉淀。他们还引入了m⁶A spike-in和ERCC spike-in来分别校准m⁶A-IP的效率和表达水平的变异性。通过比较caRNA和poly(A)+RNA的m⁶A谱，研究发现caRNA m⁶A-Seq能够特异性捕获新生转录本，并在逆转录转座子RNA上鉴定到大量的m⁶A修饰。

m⁶A在逆转录转座子RNA上的分布特征

通过caRNA m⁶A-Seq分析，研究人员在拟南芥中鉴定出242个逆转录转座子RNA上的m⁶A峰，这些m⁶A修饰的逆转录转座子RNA主要位于着丝粒周围异染色质区域。与mRNA中m⁶A通常富集在3'UTR不同，逆转录转座子转录本上的m⁶A分布在整个转录本上，特别是在5'和3'末端有高度富集。 motif分析发现逆转录转座子RNA上的m⁶A峰聚集为WAC motif（W表示A或U），与mRNA中经典的RAC motif（R表示A或G）一致。

在不同类型的逆转录转座子中，COPIA、GYPSY和LINE家族分别含有108、88和43个m⁶A峰，对应48、61和24个转录本，而SINE家族的m⁶A峰较少。通过m⁶A-IP-qPCR验证，确认了COPIA62和COPIA66等代表性逆转录转座子上的m⁶A富集是真实存在的。

m⁶A写入器复合体对逆转录转座子的调控作用

为了研究m⁶A在拟南芥逆转录转座子中的调控功能，研究人员使用了m⁶A MTA-MTB写入器复合体的亚基突变体fip37-4 LEC1::FIP37和vir。caRNA m⁶A-Seq分析显示，与野生型相比，这些突变体中逆转录转座子RNA上的m⁶A水平全局性降低，超过80%的m⁶A逆转录转座子RNA表达上调。这表明MTA-MTB写入器复合体负责在这些RNA上安装m⁶A修饰，而m⁶A甲基化抑制了逆转录转座子RNA的丰度。

CPSF30-L识别并结合m⁶A逆转录转座子RNA

CPSF30-L是拟南芥中的核内m⁶A阅读器蛋白。研究人员发现，CPSF30-L通过其m⁶A结合功能抑制m⁶A逆转录转座子RNA的表达水平。在cpsf30-l突变体中，m⁶A逆转录转座子RNA的表达显著上调，而这一表型可以通过表达野生型CPSF30-L回补，但不能被m⁶A结合功能缺失的CPSF30-Lm回补。

通过核FA-CLIP（甲醛交联辅助的免疫共沉淀）实验，证实CPSF30-L特异性结合m⁶A修饰的逆转录转座子RNA。CPSF30-L对m⁶A逆转录转座子RNA的结合强度显著高于非m⁶A RNA。FA-RIP-qPCR和qPCR实验进一步验证了CPSF30-L直接结合逆转录转座子RNA并以其m⁶A依赖的方式抑制其丰度。

m⁶A通过转录抑制而非RNA稳定性调控逆转录转座子

为了探究m⁶A调控逆转录转座子表达的机制，研究人员进行了核RNA衰变实验。结果显示，在vir和cpsf30-l突变体中，m⁶A逆转录转座子RNA的半衰期与非m⁶A逆转录转座子RNA相当，表明m⁶A并不影响逆转录转座子RNA的稳定性。这一发现与哺乳动物中的机制不同，在哺乳动物中m⁶A可通过促进逆转录转座子RNA降解来调控其丰度。

相反，通过监测新生转录本的转录速率，研究发现cpsf30-l突变体中m⁶A逆转录转座子RNA的转录速率显著上调。核run-on实验进一步证实，m⁶A写入器或阅读器的功能缺失会导致逆转录转座子转录速率增加。这些结果表明m⁶A通过抑制转录活性而不是影响RNA稳定性来调控逆转录转座子表达。

m⁶A通过增强组蛋白修饰维持异染色质状态

研究人员进一步探讨了m⁶A如何影响染色质状态。他们发现大多数m⁶A逆转录转座子RNA与两种抑制性异染色质修饰相关：H3K9二甲基化（H3K9me2）和H3K27单甲基化（H3K27me1）。在m⁶A修饰的逆转录转座子区域，H3K9me2和H3K27me1水平显著高于非m⁶A区域。

免疫染色实验显示，在fip37-4 LEC1::FIP37、vir和cpsf30-l突变体中，H3K9me2和H3K27me1信号轻微但明显减少。在cpsf30-l突变体中，这一表型可通过表达CPSF30-L回补，但不能被CPSF30-Lm回补，表明CPSF30-L的m⁶A结合功能调控H3K9me2和H3K27me1水平。

基因组范围的ChIP-Seq分析进一步证实，m⁶A写入器亚基VIR或m⁶A阅读器CPSF30-L的功能缺失会部分降低H3K9me2和H3K27me1水平，特别是在m⁶A修饰的逆转录转座子区域。ChIP-qPCR实验也验证了m⁶A写入器突变体或cpsf30-l中COPIA22和ATRE1位点上的H3K9me2和H3K27me1水平降低。

CPSF30-L与组蛋白甲基转移酶的相互作用机制

为了阐明m⁶A介导组蛋白修饰的分子机制，研究人员发现CPSF30-L与H3K9me2甲基转移酶SUVH4/5/6和H3K27me1甲基转移酶ATXR5/6发生物理相互作用。通过酵母双杂交、双分子荧光互补和半体内pull-down实验，证实了这些蛋白质之间的直接相互作用。

重要的是，CPSF30-L的功能缺失会部分降低SUVH4/5/6依赖的H3K9me2和ATXR5/6依赖的H3K27me1水平，但对SUVH4/5/6非依赖或ATXR5/6非依赖的峰影响很小。这表明m⁶A通过其相应的甲基转移酶部分调控H3K9me2和H3K27me1的沉积。

ECT12作为另一个核m⁶A阅读器

研究人员发现ECT12是另一个核m⁶A阅读器蛋白，它与CPSF30-L相互作用并增强m⁶A结合功能。系统发育分析显示，ECT12是拟南芥中YTHDC1的同源物。体外和体内实验证实ECT12通过其YTH结构域特异性结合m⁶A修饰的RNA。

ECT12与CPSF30-L在物理上相互作用，两者共同作用时比单独作用时能结合更多的m⁶A修饰的poly(A)+ RNA。遗传分析显示，CPSF30-L和ECT12在调控异染色质组蛋白修饰和m⁶A逆转录转座子RNA转录方面存在功能冗余。cpsf30-l ect12双突变体比单个突变体表现出更显著的H3K9me2和H3K27me1水平降低，以及m⁶A逆转录转座子RNA表达上调。

研究结论与意义

本研究揭示了植物中m⁶A调控逆转录转座子转录和异染色质状态的新机制。m⁶A写入器复合体（MTA-MTB）在逆转录转座子RNA上安装m⁶A修饰，这些修饰被核内阅读器蛋白CPSF30-L和ECT12识别。CPSF30-L通过直接与组蛋白甲基转移酶SUVH4/5/6和ATXR5/6相互作用，招募这些酶到m⁶A标记的逆转录转座子区域，促进抑制性组蛋白标记H3K9me2和H3K27me1的沉积，从而导致染色质闭合和转录抑制。

该研究的创新点在于首次在植物中揭示了表观转录组（m⁶A）与表观基因组（组蛋白修饰）之间的直接联系，阐明了RNA修饰信息如何流向染色质以确保转录沉默和异染色质完整性的机制。与哺乳动物中m⁶A主要通过影响RNA稳定性来调控逆转录转座子不同，植物中m⁶A主要作用于转录水平，体现了物种特异的调控机制。

这一发现不仅深化了我们对植物表观调控网络的理解，也为作物遗传改良提供了新思路。鉴于逆转录转座子在作物基因组中占更大比例，且其转录激活可能与环境挑战和适应性进化相关，理解m⁶A如何调控逆转录转座子转录可能有助于开发新的作物育种策略。最近的研究表明，在水稻中表达FTO（一种m⁶A去甲基化酶）可以增加产量和生物量，这进一步表明表观转录组调控在作物改良中具有巨大潜力。

关键技术方法

本研究采用了多种关键技术方法：染色质相关RNA m⁶A测序（caRNA m⁶A-Seq）用于全基因组检测m⁶A修饰；核FA-CLIP用于分析蛋白质-RNA相互作用；核RNA衰变实验评估RNA稳定性；时间进程RNA测序测量转录速率；核run-on实验直接检测转录活性；ChIP-Seq分析组蛋白修饰分布；酵母双杂交、双分子荧光互补和半体内pull-down验证蛋白质相互作用；免疫染色观察组蛋白修饰水平变化。所有实验均使用6天大的拟南芥幼苗为材料，确保实验结果的可比性和可靠性。