在受到五种非生物胁迫的Dianthus spiculifolius中，用于实时定量PCR的参考基因的鉴定与筛选

《Plant Stress》：Identification and selection of reference genes for real-time quantitative PCR in Dianthus spiculifolius subjected to five abiotic stresses

景天科刺芒景天（Dianthus spiculifolius）在干旱、低温、ABA、镉及铅胁迫下的稳定参考基因（RGs）研究。通过geNorm、NormFinder和BestKeeper三种算法分析14个候选RGs，发现DsPTBP1在多数胁迫下最稳定，DseIF-4a在镉胁迫下最稳定，DsTBP2最不稳定。验证靶基因DsCBL2表达一致性，确认稳定RGs对RT-qPCR结果的影响。本研究首次系统筛选刺芒景天RGs，为后续基因功能解析奠定基础。

　　在东北地区，作为一种低矮、丛生且外观优美的景观植物和生态修复材料，Dianthus spiculifolius因其卓越的抗逆性和对贫瘠土壤环境的强适应性而具有极高的应用价值。然而，目前对于其生长和应激反应的分子机制仍知之甚少。因此，识别稳定的参考基因是实现RT-qPCR研究中基因表达标准化的关键前提，对于进一步探索该物种的分子机制至关重要。本研究通过实时定量PCR（RT-qPCR）分析了在干旱、低温、脱落酸（ABA）和铅（Pb）等非生物胁迫条件下，D. spiculifolius幼苗中14个候选参考基因的表达水平。我们使用了三种软件程序来评估这些基因的表达稳定性。综合分析结果显示，DsPTBT1在干旱、低温、ABA和Pb胁迫下是最稳定的参考基因，而DseIF-4a则在镉（Cd）胁迫下是最适合的参考基因。此外，DsTBP2在所有处理中，除了Cd胁迫外，都是最不稳定的基因。我们还使用了两个最佳和一个次优的参考基因来校准目标基因DsCBL2的表达模式，从而验证了这一观点。本研究首次鉴定了D. spiculifolius的稳定参考基因，为该物种及相关的Dianthus物种的基因表达分析奠定了重要基础。

在引入和介绍部分，D. spiculifolius被描述为一种重要的园艺植物，具有多种繁殖方式和适应性。其在极端干旱、贫瘠土壤和低温条件下表现出良好的适应性，这使其在生态修复方面具有巨大潜力。例如，这些植物能够在东北地区-40°C的严寒条件下存活。这种强大的适应性主要归因于其独特的分子调控机制。从野生植物中利用抗逆基因及其独特的抗逆机制，是提高经济作物抗逆性的高效方法之一。例如，从D. spiculifolius中提取的DsCER26基因能够在不影响稻谷营养成分的前提下提高水稻的脱水耐受性。此外，D. spiculifolius对镉（Cd）和铅（Pb）胁迫具有更高的耐受性，并且比其他Dianthus物种如Dianthus barbatus, Dianthus caryophyllus, Dianthus chinensis, Dianthus deltoides和Dianthus superbus表现出更强的重金属积累能力。D. spiculifolius具有较大的生物量和快速生长的根系，这使其成为重金属修复的潜在候选植物。因此，D. spiculifolius不仅在景观应用中具有重要价值，同时其独特的抗逆机制也为经济作物的遗传改良提供了宝贵的参考。

以往的研究已经通过转录组数据筛选出了一些在D. spiculifolius中被诱导表达的抗逆基因，这些基因能够响应干旱、低温或重金属胁迫。然而，这些结果必须通过实时定量PCR（RT-qPCR）进行验证，而RT-qPCR的准确性依赖于合适的内参基因。目前尚未对D. spiculifolius在不同胁迫条件下使用合适的参考基因进行研究。因此，有必要对D. spiculifolius中抗逆基因的最优参考基因进行调查和确定。

在选择合适的参考基因时，确保RT-qPCR结果的准确性和可靠性是至关重要的。选择不合适的参考基因会导致不准确的标准化和误导性的结论。理想的内参基因应在植物发育的不同阶段、不同组织和对环境变化的响应中表现出稳定的表达。常被用作传统参考基因的管家基因，因其维持基本细胞活动和在不同条件下的稳定空间和时间表达而广受认可。然而，越来越多的证据表明，常用的参考基因在不同植物物种或不同条件下并不总是稳定的。例如，在Carex rigescens中，SAND家族蛋白（SAND）和真核翻译起始因子4A基因（eIF-4a）在盐和热胁迫下是最稳定的参考基因，而在冷和PEG处理下，甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）和Actin7是两个最稳定的参考基因。在Nitraria tangutorum中，延长因子-1α基因（EF-1a）表现出最高的表达稳定性，而热休克蛋白（HSP）则在不同器官和非生物胁迫下是最不合适的参考基因。在Nitraria sibirica中，微管α链样蛋白（TUB）在脱落酸处理的根部是最稳定的参考基因，但在盐处理的叶片中是最不稳定的参考基因。在西藏药材中，蛋白磷酸酶2A（PP2A）基因在水杨酸处理下表现出良好的稳定性，但在ABA处理下稳定性较低。在Cymbidium lowianum中，Actin7在背面唇、正面唇和花瓣中的表达模式不稳定，但在花瓣中表现出最稳定的表达模式。此外，不同物种的参考基因也有所不同。在Corylus heterophylla × Corylus avellana中，EF-1α在自交和杂交后表现出最高的稳定性，但在Prunus persica和Solanum lycopersicum中却是最不稳定的基因之一。在胡萝卜中，Actin在非生物胁迫和激素刺激下表现出良好的稳定性，但在芹菜中却是最不稳定的基因。环氧化酶2（CYP2）在Glehnia littoralis中在盐胁迫下表现出高度稳定性，但在牧草中则表现出较低的稳定性。因此，通过qPCR结果的标准化选择适当的、稳定表达的参考基因，是筛选和鉴定D. spiculifolius抗逆基因的最重要步骤。

本研究中，我们基于之前对D. spiculifolius在干旱和低温胁迫下的转录组分析，选择了14个候选参考基因，包括60S核糖体蛋白（DsRPL）、多聚嘧啶区结合蛋白（DsPTBP1）、延长因子1α（DsEF-1a）、肌动蛋白-11（DsACT11）、TIP41样蛋白（DsTIP41）、核帽结合蛋白（DsNCBP）、真核翻译起始因子4A（Dself-4α）、ADP-核糖化因子3（DsARF3）、TATA结合蛋白2（DsTBP2）、微管α-2链（DsTUA）、丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶2A（DsPP2A）、多泛素（DsUBQ10）、微管β链2（DsTUB2）和肌动蛋白-7（DsACT7）。这些候选参考基因的表达水平通过RT-qPCR在干旱、低温、ABA、Cd和Pb胁迫条件下进行放大。使用geNorm、NormFinder和BestKeeper三种算法评估了这些基因的稳定性。根据上述分析，我们通过钙调素B样蛋白（DsCBL2）验证了参考基因的可靠性。本研究是首次系统分析D. spiculifolius中的最优候选参考基因，为理解该物种及其相关Dianthus物种的基因表达和抗逆机制奠定了基础。

在结果部分，我们首先选择了候选参考基因（RGs）。基于我们之前对D. spiculifolius在干旱和低温胁迫下的转录组数据，从三十四个传统参考基因中筛选出了十四种候选参考基因（Table S1）。我们使用转录组数据中FPKM值的变异系数（CV）小于0.3作为筛选标准，从三十四个传统参考基因中筛选出十四种候选的管家基因（Table 1和Table S1）。这些候选基因随后被用于查询Arabidopsis thaliana数据库，以获得其同源基因（Table S1）。所有引物均基于D. spiculifolius转录组数据库中的编码序列（Table 2）。通过琼脂糖凝胶电泳（Fig. S1A）和RT-qPCR的熔解曲线分析（Fig. S1B-O），我们确认了引物扩增出的单一条带具有预期大小。候选参考基因的标准曲线的扩增效率（E）和相关系数（R2）分别在91.09%到113.14%和0.9864到0.9998之间（Table 2）。因此，本研究中使用的候选基因引物均表现出特异性和高效性。

接下来，我们分析了候选参考基因的表达谱。表达谱通过干旱、低温、ABA、Cd和Pb胁迫条件下14种候选参考基因的循环阈值（Ct）值来表示（Fig. 1）。候选参考基因的Ct值范围从14.62（DsEF-1a）到33.45（DsTUA）（Fig. 1）。候选参考基因的平均Ct值在16.58到25.57之间，标准差（SD）在0.57到3.61之间，变异系数（CV）在2.66%到18.48%之间（Fig. 2和Table 2）。一般来说，Ct值较低的基因被认为具有较高的表达水平。DsEF-1a的平均Ct值最低，表明其表达丰富度最高。而DsACT11和DsNCBP的表达水平最低，其Ct值分别为25.57和22.57（Fig. 1）。此外，DsPTBP1的Ct值范围最窄（20.31–22.23），而DsTUA的Ct值范围最宽（17.05–33.45），DseIF-4a的Ct值变化相对温和，范围在17.21到19.98之间。Ct值的变异系数较低表明该基因在样本中表现出较高的稳定性。根据所有处理的平均CV值，候选参考基因的稳定性排名为DsPTBP1 > DsPP2A > DsNCBP > DsTIP41 > DsACT11 > DsARF3 > DseIF-4a > DsACT7 > DsTUB2 > DsEF-1a > DsTBP2 > DsUBQ10 > DsRPL > DsTUA（Table 2）。这些结果表明，候选参考基因的表达水平在不同胁迫条件下存在差异。因此，必须在特定环境条件下识别适合D. spiculifolius的参考基因。

使用geNorm算法对候选参考基因在特定环境胁迫下的表达稳定性进行了分析。通过计算候选参考基因的M值，并根据这些值对基因稳定性进行排序。M值小于1.5的基因被认为具有稳定的表达，而较小的M值表示更高的表达稳定性（Vandesompele et al., 2002）。在本研究中，所有候选参考基因在单独处理和组合处理下的M值均小于1.5。最佳参考基因在不同处理中有所不同。干旱胁迫下，DsPP2A和DsPTBP1的M值最低，表明其表达最稳定。低温胁迫下，DsNCBP和DsACT7的M值最低。ABA胁迫下，DsRPL和DsTUB2的M值最低。Cd胁迫下，DsTUB2和DseIF-4a的M值最低。Pb胁迫下，DsARF3和DsRPL的M值最低。在所有处理组合下，DsTIP41和DsEF-1a的M值最低。相比之下，不稳定的参考基因在干旱和低温胁迫下为DsTBP2，在ABA胁迫下为DsTUA和DsTBP2，在Cd胁迫下为DsUBQ10和DsTBP2，在Pb胁迫下为DsTUB2和DsTBP2，在组合胁迫下为DsTUA。geNorm算法被用来分析14个候选参考基因在不同胁迫条件下的配对变异值（Vn/Vn+1），以确定在不同胁迫条件下所需的参考基因数量。根据先前的研究，当Vn/(n+1)值小于0.15时，n被认为是对数据标准化所需的最佳参考基因数量（Vandesompele et al., 2002）。在本研究中，除了冷胁迫下的V9/10和ABA处理下的V13/14外，所有胁迫和组合胁迫下的V2/3值均小于0.15。这表明两个参考基因的几何平均值足以标准化目标基因的表达（Fig. 3）。

在NormFinder分析中，我们评估了候选参考基因的稳定性，通过计算组内和组间的变异，并根据稳定性值对基因进行排序（Andersen et al., 2004）。稳定性值最小的基因被认为是最佳参考基因。如Table 4所示，在干旱和Pb胁迫下，DsEF-1a是最稳定的参考基因，其M值分别为0.018和0.015。在ABA胁迫下，DsARF3（0.031）是最稳定的参考基因。一些NormFinder的结果与geNorm的结果相似。在低温胁迫下，前三位最稳定的基因是DsPTBP1（0.02）、DsTIP41（0.02）和DsNCBP（0.055），这与geNorm的结果一致。NormFinder指出，DseIF-4a（0.032）是最适合的参考基因。在Cd胁迫下，其结果与geNorm相似。根据geNorm软件分析，DsTBP2在干旱和低温条件下被认为是表达最不稳定的基因，其较高的M值表明表达不稳定，因此不适合用作参考基因。

使用BestKeeper算法，我们基于RT-qPCR测量得到的Ct值的SD和CV值来识别适合的参考基因。较小的SD和CV值表明参考基因的稳定性较高。相反，SD值大于1表明基因表达不稳定（Pfaffl et al., 2004）。如Table 5所示，BestKeeper分析的结果表明，DsPTBP1在干旱、低温、ABA、Pb和组合样本中是最稳定的参考基因，但在Cd胁迫下并非最稳定的基因。CV ± SD值分别为0.66 ± 0.14、1.53 ± 0.33、2.17 ± 0.46、1.38 ± 0.30、2.22 ± 0.47和3.37 ± 0.72。对于Cd胁迫，DsACT7（3.48 ± 0.63）被确定为最稳定的基因。在冷、ABA、Cd、Pb和组合样本中排名最后或倒数第二，且SD值大于1.0的基因表明候选参考基因的稳定性相对较低。DsTBP2在各种胁迫条件下表现出相对不稳定的表达，并且在不同处理中排名最后、倒数第二或第三。具体而言，其CV ± SD值分别为4.1 ± 0.94（干旱）、4.7 ± 1.06（低温）、6.16 ± 1.35（ABA处理）、4.87 ± 1.11（Cd胁迫）、4.44 ± 1.01（Pb胁迫）和3.62 ± 0.8（总处理）。总的来说，参考基因的不稳定性与geNorm和NormFinder分析的结果一致。

综合分析部分，我们对来自三种算法（geNorm、NormFinder和BestKeeper）的候选参考基因结果进行了综合评估，赋予适当的权重。然后计算了所有算法输出的几何平均值，以生成总体排名并实现全面评估（Li et al., 2020b）。这些结果表明，较小的值对应更稳定的基因。如Table 6所示，在干旱、低温、ABA、Pb和组合样本中，DsPTBP1的稳定性排名最高。此外，在Cd胁迫下，DseIF-4a和DsTUB2表现出稳定的表达。DsPP2A、DsNCBP、DsARF3和DseIF-4a在干旱、低温、ABA和Pb胁迫下分别为第二稳定的参考基因。在干旱、低温、ABA和Pb胁迫下，DsTBP2表现出最低的稳定性，而在Cd胁迫下，DsNCBP表现出最低的稳定性。

在验证部分，我们选择了DsCBL2作为目标基因，以验证本研究中鉴定的参考基因的可靠性。钙调素B样蛋白（CBLs）作为钙传感器，与丝氨酸和苏氨酸蛋白激酶相互作用，广泛存在于陆生植物中，并参与对各种胁迫类型的反应（Li et al., 2009）。DsCBL2的序列来源于D. spiculifolius的转录组数据（Zhou et al., 2017），并显示出与Arabidopsis thaliana中CBL的76.77%核苷酸同源性。我们使用了综合排名分析中确定的两个最佳和一个最不稳定的参考基因对DsCBL2的表达进行标准化，以验证稳定性排名的可靠性。所选的参考基因包括在干旱胁迫下使用DsPTBP1、DsPP2A和DsTBP2，在低温胁迫下使用DsPTBP1、DsNCBP和DsTBP2，在ABA胁迫下使用DsPTBP1、DsARF3和DsTBP2，在Cd胁迫下使用DseIF-4a、DsTUB2和DsNCBP，在Pb胁迫下使用DsPTBP1、DseIF-4a和DsTBP2。如Table 6和Fig. 5所示，当使用两个稳定的参考基因进行标准化时，DsCBL2的相对表达模式显示出相似的趋势。相反，当使用不稳定的参考基因进行相对定量时，DsCBL2的相对表达模式表现出显著不一致的趋势。例如，在干旱条件下，与最稳定的参考基因（DsPTBP1和DsPP2A）相比，使用DsTBP2作为参考基因时，DsCBL2的表达趋势表现为先增加后减少（Fig. 5A）。在低温胁迫下，当使用最稳定的参考基因（DsPTBP1和DsNCBP）进行标准化时，DsCBL2的表达增加。然而，当使用DsTBP2作为参考基因时，未观察到DsCBL2表达的显著变化；同样的现象也出现在ABA胁迫下（Fig. 5B和C）。在Cd胁迫下，当使用不同参考基因进行标准化时，DsCBL2的表达水平没有显著变化（Fig. 5D）。在Pb胁迫下，当使用最稳定的参考基因（DsPTBP1和DseIF-4a）进行标准化时，24小时后未观察到DsCBL2表达的显著变化。然而，当使用不稳定的参考基因DsTBP2进行标准化时，24小时后观察到DsCBL2表达的增加（Fig. 5F）。总的来说，使用稳定的内部参考基因对D. spiculifolius的基因表达进行标准化可以产生可靠的结果。本研究强调了在不同胁迫条件下筛选稳定参考基因的重要性。

在讨论部分，我们进一步探讨了本研究的发现及其对植物基因表达分析的意义。由于D. spiculifolius是一种具有极端耐旱、耐寒和耐重金属能力的野生植物，因此对其抗逆基因的研究不仅有助于拓展其应用，也为经济作物的遗传改良提供了遗传资源和技术参考。RT-qPCR是一种用于快速和可靠地表达抗逆基因的重要技术。由于RT-qPCR依赖于使用合适的参考基因进行标准化，以最小化样本制备和反应过程中的变异，因此选择合适的参考基因对于获得准确和可靠的定量数据至关重要。已有研究表明，同一物种中，最佳参考基因可能因组织、发育阶段和胁迫条件的不同而存在显著差异。然而，目前尚未对D. spiculifolius进行系统性的参考基因筛选。因此，本研究首次在D. spiculifolius在非生物胁迫条件下的系统筛选，为该物种及其相关Dianthus物种的基因挖掘和功能研究提供了可靠的科技支持，并确保了实验结果的准确性。

在本实验中，我们使用三种算法（geNorm、NormFinder和BestKeeper）对候选参考基因的稳定性进行了评估。geNorm通过计算候选参考基因在不同条件下的表达水平来评估其稳定性（Vandesompele et al., 2002）。M值越小，参考基因的稳定性越高，但M值≤1.5通常被认为是可接受的。根据geNorm算法确定的最佳参考基因数量，当Vn/(n+1) < 0.15时，应选择n个参考基因以确保目标基因表达的准确标准化；否则，应选择n+1个参考基因。NormFinder通过计算候选基因表达的稳定性值来确定最合适的参考基因。稳定性值越小，基因表达越稳定。BestKeeper通过计算候选基因在不同样本中的SD和CV值来评估其稳定性。CV ± SD值用于确定参考基因的稳定性。

在本研究中，DsPTBP1被确定为在干旱、低温、ABA、Pb和所有组合样本中稳定性最高的参考基因，而在Cd胁迫下，DseIF-4a是最适合的参考基因。此外，DsTBP2在干旱、低温、ABA和Pb胁迫下表现出最低的稳定性，而在Cd胁迫下，DsNCBP表现出最低的稳定性。这些结果表明，参考基因的稳定性可能因物种、发育阶段和胁迫条件的不同而有所差异。因此，选择适合的参考基因对于植物的功能研究至关重要。我们使用DsCBL2作为目标基因来验证所选参考基因的可靠性。在干旱、低温和ABA、Cd和Pb胁迫条件下，我们使用了两个最佳参考基因和一个最不稳定的参考基因对DsCBL2的表达进行标准化。结果表明，当使用两个最稳定的参考基因时，DsCBL2的相对表达模式显示出相似的趋势，而当使用最不稳定的参考基因时，其相对表达模式则表现出显著不一致的趋势。这些结果验证了我们所选参考基因的稳定性，并突显了选择适当参考基因进行RT-qPCR分析的重要性。

在结论部分，本研究旨在识别适合D. spiculifolius的参考基因，以确保在四种不同的胁迫条件下获得准确的RT-qPCR结果。我们从多个RNA-seq数据集中鉴定了14个新的候选参考基因，并通过三种广泛认可的算法对其稳定性进行了评估。通过综合分析，我们得出了参考基因的总体排名，从而解决了不同算法得出的差异。研究发现，DsPTBT1、DsPP2A、DsNCBP、DsARF3、DseIF-4a和DsTUB2是稳定性最高的参考基因，而DsTBP2则是稳定性最低的参考基因。我们建议在干旱、低温、ABA、Cd和Pb胁迫的RT-qPCR研究中使用DsPTBT1和DseIF-4a作为参考基因。

在材料与方法部分，我们首先选择了植物材料和处理条件。D. spiculifolius的幼苗由东北农业大学提供。植物材料在半强度的Murashige和Skoog（MS）基础培养基中培养，培养基中添加了2%（w/v）的蔗糖，并用0.6%（w/v）的琼脂固化（Qiao et al., 2023）。培养过程在控制环境生长室中进行，生长室程序设置为12小时光照周期（光照阶段的光强为200 μmol m?2 s?1），交替进行12小时的黑暗期。我们选择了生长一致且发育旺盛的1个月大的幼苗进行非生物胁迫处理。对于干旱、ABA、Cd和Pb胁迫实验，培养基分别添加了20% PEG6000、100 μM ABA、80 μM CdSO?和750 μM Pb(NO?)?溶液。对于低温胁迫处理，1个月大的幼苗被转移到光照培养箱中，并在特定时间内暴露于-10°C。所有胁迫处理均在0、12、24和48小时进行，每个时间点进行三次生物学重复。实验结束后，通过液氮快速冷冻并保存于-80°C，以提取RNA。

接下来，我们选择了候选参考基因并设计了引物。本研究基于之前对D. spiculifolius在干旱和低温胁迫下的转录组分析，选择了14个候选参考基因，包括60S核糖体蛋白（DsRPL）、多聚嘧啶区结合蛋白（DsPTBP1）、延长因子1α（DsEF-1a）、肌动蛋白-11（DsACT11）、TIP41样蛋白（DsTIP41）、核帽结合蛋白（DsNCBP）、真核翻译起始因子4A（Dself-4α）、ADP-核糖化因子3（DsARF3）、TATA结合蛋白2（DsTBP2）、微管α-2链（DsTUA）、丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶2A（DsPP2A）、多泛素（DsUBQ10）、微管β链2（DsTUB2）和肌动蛋白-7（DsACT7）。这些候选参考基因的同源序列通过查询Arabidopsis thaliana数据库获得（Table S1）。候选参考基因的引物基于D. spiculifolius转录组数据库中的编码序列（Table 2）。通过琼脂糖凝胶电泳（Fig. S1A）和RT-qPCR的熔解曲线分析（Fig. S1B-O），我们确认了引物扩增出的单一条带具有预期大小。候选参考基因的标准曲线的扩增效率（E）和相关系数（R2）分别在91.09%到113.14%和0.9864到0.9998之间（Table 2）。因此，本研究中使用的候选基因引物均表现出特异性和高效性。

在RNA提取和cDNA制备部分，我们使用TRIzol试剂（Invitrogen, Waltham, MA, USA）从每个样本中提取总RNA。RNA样品的质量良好，其A260/A280比值在1.8到2.0之间，A260/A230比值大于2.0。合格的RNA使用HiScript III 1st Strand cDNA Synthesis Kit (+gDNA wiper)（Vazyme, Nanjing, China）以500 ng的总RNA为模板进行逆转录，以制备cDNA。每个实验包括使用不同稀释度的cDNA模板构建标准曲线，以确定相关系数（R2）并评估扩增效率（E）。E值的计算公式为E% = (?1 + 10^[?1/slope]) × 100%（Li et al., 2020b）。cDNA被稀释五倍后用于RT-qPCR分析，并在-20°C下保存以备后续使用。

在实时RT-qPCR分析部分，我们使用了96孔板（Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA）和Hieff qPCR SYBR Green Master Mix（YEASEN, Shanghai, China）进行实时RT-qPCR分析（Li et al., 2024）。反应混合物的制备和PCR反应均按照制造商的说明进行。循环阈值（Ct）值≤35的样本被纳入后续分析。每个样本的PCR反应均进行了三次技术重复。候选参考基因的CV和SD值基于所有样本的Ct值进行计算（Table 2）。

在基因表达稳定性统计分析部分，我们使用geNorm、NormFinder和BestKeeper三种算法对候选参考基因的稳定性进行了分析。geNorm通过计算不同条件下候选参考基因的表达水平来评估其稳定性（Vandesompele et al., 2002）。M值越小，参考基因的稳定性越高，但M值≤1.5通常被认为是可接受的。根据geNorm算法确定的最佳参考基因数量，当Vn/(n+1) < 0.15时，应选择n个参考基因以确保目标基因表达的准确标准化；否则，应选择n+1个参考基因。NormFinder通过计算候选基因表达的稳定性值来确定最合适的参考基因。稳定性值越小，基因表达越稳定。BestKeeper通过计算候选基因在不同样本中的SD和CV值来评估其稳定性。CV ± SD值用于确定参考基因的稳定性。

在验证所选参考基因的部分，我们选择了DsCBL2作为目标基因，以验证所选参考基因的可靠性。DsCBL2的表达通过使用综合排名分析中确定的两个最佳和一个最不稳定的参考基因进行标准化。所使用的DsCBL2引物为DsCBL2F（CTGCACAGACGCAATTCAGC）和DsCBL2R（TGCCTCTATTTCGCTCACACT）。DsCBL2的相对基因表达水平使用2?△△Ct方法进行计算（Zhang et al., 2024）。使用Microsoft Excel和GraphPad Prism 7生成图表。结果基于三个生物学重复和三个技术重复进行计算。

本研究的主要贡献在于首次系统地筛选了D. spiculifolius在非生物胁迫条件下的稳定参考基因。这不仅为该物种的基因表达分析提供了基础，也为相关Dianthus物种的进一步研究提供了参考。通过三种不同的算法（geNorm、NormFinder和BestKeeper）对候选参考基因的稳定性进行评估，使得我们能够更全面地理解不同胁迫条件下基因表达的稳定性。这些发现表明，参考基因的选择需要根据具体的实验条件进行调整，以确保基因表达数据的准确性。此外，研究还强调了在植物基因表达分析中选择合适参考基因的重要性，这有助于提高实验的可靠性和有效性。通过使用DsCBL2作为目标基因进行验证，我们进一步确认了所选参考基因的稳定性，这为未来的基因功能研究提供了坚实的基础。