综述：植物生物与非生物胁迫下miRNA及其调控网络的研究技术

本综述系统阐述了植物miRNA在生物胁迫（病原菌、害虫）和非生物胁迫（高温、低温、干旱、盐碱、重金属）下的作用机制，详细介绍了Northern blotting、Real-time qPCR、双荧光素酶报告系统等经典研究技术，并整合了降解组测序等组学方法。文章重点解析了miRNA通过调控抗氧化酶（SOD、POD）、激活植物激素信号通路（ABA、JA）及直接调控防御相关基因等新型机制增强植物抗逆性的分子网络，为抗逆育种提供了重要理论依据。

　　

植物微小RNA的应激防御之道

在植物生长过程中，各种环境压力无时无刻不在考验着它们的生存能力。其中，一类名为微小RNA（miRNA）的非编码RNA分子，虽然只有约20-24个核苷酸的长度，却在植物应对胁迫的防御网络中扮演着核心指挥者的角色。

miRNA的生物合成与作用机制

miRNA的诞生始于细胞核内。RNA聚合酶II（Pol II）首先转录出初级miRNA转录本（pri-miRNA），这些转录本具有独特的茎环结构。随后，DCL1酶复合物在HYL1和SERRATE等辅助因子的帮助下，逐步将其加工成前体miRNA（pre-miRNA），并最终成熟为miRNA/miRNA*双链。经过HEN1甲基化酶的修饰增强稳定性后，双链通过HASTY转运蛋白被运送至细胞质。在这里，成熟的miRNA链被装载进ARGONAUTE1（AGO1）蛋白组成的RNA诱导沉默复合体（miRISC）中，执行其基因调控使命。

miRNA调控靶基因主要通过两种方式：当miRNA与靶信使RNA（mRNA）序列近乎完全互补时，AGO蛋白会像“分子剪刀”一样直接切割靶m使使其降解；当互补性不完全时，miRNA则主要通过抑制靶基因的翻译过程来发挥作用。

探究miRNA的利器：研究技术演进

从1970年代末Northern blotting首次用于RNA检测开始，科学家们便踏上了探索小RNA功能的征程。这项技术通过特异性探针杂交，实现了对miRNA表达的初步定性分析。随着对分子定量需求的增长，1996年实时荧光定量PCR（Real-time qPCR）技术的出现，使得精确量化miRNA成为可能。同期，双荧光素酶报告系统为验证miRNA与靶基因之间的序列特异性相互作用提供了强大平台。

进入21世纪，RLM-5′RACE技术成为验证miRNA直接切割靶位点的“金标准”。随着基因组学兴起，基于序列互补性的生物信息学算法实现了miRNA靶标的全基因组预测，大大加速了功能筛选。2004年，降解组测序（Degradome sequencing）技术的引入，能够在全基因组范围内系统性识别miRNA的切割靶标，标志着高通量研究时代的到来。这些技术从单基因验证到系统分析的逐步演进，构建起一套完整的miRNA功能研究方法体系。

miRNA在生物胁迫防御中的战术

当病原菌或害虫侵袭时，植物会迅速启动多层防御系统，miRNA在其中充当了精准的“调度员”。

在葡萄中，miR827a通过靶向转录因子VqMYB14，负向调控植物免疫。VqMYB14能直接激活芪合酶（STS）基因，促进抗菌物质芪类化合物的合成。当葡萄受到病原菌攻击时，miR827a的表达下调，解除了对VqMYB14的抑制，从而增强芪类化合物积累和抗病性。

在水稻中，抑制miR1871能够通过促进细胞壁相关基因MFAP1的表达，增强病原菌相关分子模式触发免疫（PTI），使转基因水稻在提高对稻瘟病抗性的同时，还增加了穗数。

在对抗虫害方面，大豆胞囊线虫（SCN）的侵染会抑制miR2119的转录。研究发现，过表达miR2119会增加感病性，而沉默miR2119则会上调GmADHs基因表达，增强活性氧（ROS）清除能力，从而提高抗性。这表明miR2119是一个重要的感病因子，成为培育抗线虫大豆品种的潜在靶标。

miRNA在非生物胁迫适应中的策略

面对高温、低温、干旱、盐碱、重金属等非生物胁迫，miRNA同样发挥着关键的调控作用。

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  高温胁迫：在番茄中，高温胁迫下miR398表达上调，抑制其靶基因CSD1和CSD2，导致超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）等抗氧化酶活性降低，ROS积累增加。令人意外的是，这种ROS的积累反而会激活热激因子（HSF）和热激蛋白（HSP）相关基因的表达，最终提升番茄的耐热性。而在黑麦草中，茉莉酸甲酯（MeJA）诱导产生的miRNAs则通过信号转导、蛋白质稳态、细胞壁调控和叶绿素代谢等多条通路来增强耐热性。
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  低温胁迫：在甘蔗中，低温胁迫下miR319表达上调，切割靶基因TCP-PCF6和GAMyb，从而减少能量消耗、延缓生长，帮助植物适应低温环境。在木薯中， miR159、miR164、miR396等12个低温响应miRNA通过调控下游转录因子网络，共同构建了耐冷基因调控网络。
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  干旱胁迫：水稻中的miR171a通过负向调控其靶基因HAM1/2/3，增强了依赖脱落酸（ABA）的干旱抗性。在杨树中，特有的miR6445通过靶向PtrNAC029转录因子来负向调控PtrGSTU23的表达，形成了一个维持ROS稳定的核心模块，从而提高了杨树的抗旱能力。
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  盐胁迫：小麦中的tae-miR408通过抑制代谢和细胞骨架相关靶基因，同时激活ABA信号通路（如NtPYL2/NtSAPK3）和促进渗透保护物质的积累，来增强渗透压稳态，提高耐盐性。在胡萝卜中，盐胁迫下dca-miR553表达下调，通过负向调控靶基因glus，促进了谷氨酸、谷胱甘肽（GSH）和脯氨酸代谢途径，增强了ROS清除能力。
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  金属胁迫：花生中的miR2916通过靶向APETALA2/ERF转录因子AhERF13，抑制了乙烯（ETH）依赖的铝（Al）耐受性。敲除miR2916能增强花生的耐铝性。水稻中的miR166在镉（Cd）胁迫下表达降低，通过负向调控OsHB4转录因子，减少了Cd从根部向地上部的转运，降低了籽粒中的Cd积累量，过表达miR166能提高水稻对Cd的耐受性。

展望

miRNA研究正从机制解析走向育种应用。未来研究需要进一步探索miRNA的进化与特异性，构建多维互作网络，并结合人工智能预测核心胁迫响应miRNA，加速抗逆种质创新。通过跨学科合作与技术革新，miRNA研究有望成为保障农业生产安全与生态可持续发展的关键突破口。