从禽类屠宰场分离产细菌素大肠杆菌及无细胞合成评估天然与工程化细菌素的抗菌潜力

《Poultry Science》：Isolation and characterization of bacteriocin-producing E. coli isolates from a poultry slaughterhouse, and cell-free production and evaluation of native and engineered bacteriocins

为解决畜禽养殖中抗生素耐药性(AMR)问题，研究人员开展从禽类屠宰场分离产细菌素大肠杆菌的研究，通过全基因组测序(WGS)鉴定细菌素基因簇(BGCs)，并利用体外无细胞蛋白合成(IV-CFPS)技术成功构建具有广谱抗菌活性的杂交细菌素，为替代抗生素提供了新策略。

　　

在当今全球公共卫生领域，抗生素耐药性（AMR）正成为最紧迫的挑战之一。特别是在食品动物生产领域，家禽业作为广泛消费的动物蛋白来源，其生产过程中抗生素的过度使用显著促进了多重耐药菌的出现和传播，其中大肠杆菌（Escherichia coli）和沙门氏菌（Salmonella spp.）尤为突出。这些病原体不仅威胁动物健康，还可能通过食物链传播给人类，加剧抗生素耐药性基因的扩散。面对这一严峻形势，寻找可持续的抗生素替代策略变得至关重要。

在这一背景下，细菌素（bacteriocins）作为核糖体合成的抗菌肽，展现出巨大潜力。与传统广谱抗生素不同，细菌素能够靶向特定病原体，同时保留有益微生物群，为病原体控制提供了更精确的方法。尤其值得注意的是，由适应肠道环境的菌株产生的细菌素，在抑制肠道病原体方面可能具有独特优势。然而，要从自然界中发掘高效、安全的细菌素生产者，并进一步优化其抗菌特性，仍需深入探索。

为此，研究人员将目光投向了家禽相关环境——特别是禽类屠宰场。这一环境不仅是病原体传播的关键环节，也是微生物竞争的重要场所，可能蕴藏着丰富的细菌素资源。通过系统筛选禽类胃肠道和屠宰场水样中的微生物群落，有望发现能够抑制大肠杆菌和沙门氏菌的天然细菌素生产者。

在这项发表于《Poultry Science》的研究中，西班牙马德里康普顿斯大学的研究团队开展了一项系统研究，旨在从禽类屠宰场环境中分离和表征产细菌素的大肠杆菌，并通过现代生物技术手段评估天然和工程化细菌素的抗菌潜力。研究团队采集了肉鸡胃肠道和屠宰场不同工段的水样，通过稀释涂布和抗菌活性筛选，从1920个分离株中鉴定出384个具有抗菌活性的菌株。随后通过随机扩增多态性DNA（RAPD-PCR）分析和16S rRNA基因测序，确定了17个遗传独特的大肠杆菌菌株进行全基因组测序和生物信息学分析。

研究采用了几项关键技术方法：通过全基因组测序（WGS）结合BAGEL和AntiSMASH软件预测细菌素基因簇；利用体外无细胞蛋白合成（IV-CFPS）系统快速生产功能性细菌素；采用重叠延伸PCR技术构建杂交细菌素基因；通过点植法（SOAT）评估抗菌活性。样本来源于西班牙一家年加工能力超过28000吨鸡肉的屠宰场，包括2020年10月和2022年7月采集的胃肠道样本，以及2021年11月采集的水样。

分离禽类屠宰场样品中对选定大肠杆菌和沙门氏菌指示菌株具有抗菌活性的肠杆菌

研究人员从肉鸡胃肠道和屠宰场加工各阶段水样中分离出1920个细菌菌落，其中384个（20%）对至少一种革兰氏阴性指示菌株表现出抑制活性。大多数活性分离株（365株，95%）抑制大肠杆菌DH5α，而对沙门氏菌有活性的菌株比例较低（4-11%）。这一结果表明禽类相关环境确实是抗菌活性菌株的丰富来源。

最活跃选定分离株的分类学鉴定

从384个活性菌株中，通过RAPD分析筛选出17个遗传独特的分离株。16S rRNA基因测序鉴定确认所有这些分离株均为大肠杆菌，反映了该物种在禽类相关环境中的优势地位。

对最活跃大肠杆菌分离株进行全基因组测序、从头组装和全面生物信息学分析，以鉴定细菌素基因簇和其他关键功能基因

全基因组分析显示所有17个菌株都携带至少一个细菌素基因簇（BGC），其中11个菌株同时编码细菌素和微菌素基因簇。细菌素M和微菌素V是最常见的BGC，分别存在于9个和11个分离株中。特别值得注意的是，大肠杆菌GTI-7G5携带4个不同的BGC，编码细菌素E1、B和M以及微菌素V。

生物信息学分析还揭示了毒力相关（VA）基因和获得性抗菌素耐药性（AMR）基因的分布情况。16个菌株携带VA基因，12个菌株含有AMR基因。然而，大肠杆菌GTI-2H6不携带任何可检测的毒力或耐药基因，凸显了其作为生物技术应用安全候选菌的潜力。

天然微菌素和细菌素的体外无细胞蛋白合成及其抗菌活性评估

研究人员成功通过IV-CFPS合成了微菌素V和细菌素M、B、Ib、E1和E7，并通过SOAT评估了它们的抗菌活性。细菌素M显示出最广谱的抗菌活性，对所有六种指示菌株均有抑制作用。微菌素V也表现出广谱活性，但对沙门氏菌1025和CECT 4396无效。细菌素B和Ib的谱系较窄，活性仅限于大肠杆菌DH5α。这些发现突显了天然细菌素在靶标特异性方面的多样性。

杂交细菌素的设计及其体外无细胞蛋白合成后的抗菌活性评估

为了扩展抗菌谱，研究人员通过重组细菌素E1、E7和M的功能域构建了杂交细菌素。功能评估显示，杂交细菌素ColE1-M、ColM-E1和ColM-E7表现出最广谱和最强的抗菌活性，对所有测试的大肠杆菌和沙门氏菌指示菌株均产生清晰的抑制圈。特别值得注意的是，ColE1-E7杂交体对副伤寒沙门氏菌CECT 554的活性比天然细菌素E1更强，尽管细菌素E7本身对该菌株没有可检测的活性。

研究结论和讨论部分强调了禽类相关环境作为细菌素资源库的价值。基因组和功能分析使得能够鉴定出具有潜在抗菌潜力的多种细菌素，涵盖不同的作用机制和广谱活性。体外无细胞蛋白合成（IV-CFPS）的使用促进了天然和杂交细菌素的快速生产和功能筛选，表明合理的结构域重组可以增强效力并扩大靶标特异性。

特别值得注意的是，鉴定出一个不含毒力和耐药基因的非致病性大肠杆菌菌株，突显了其作为益生菌开发或治疗性递送微生物载体的潜力。这些发现也验证了结构域重组作为扩大杂交细菌素抗菌谱的有效策略。尽管它们在体外表现良好，但在食品或水系统中的应用仍面临一些实际限制，包括可能被蛋白酶或饲料成分失活、加工条件下稳定性降低、生产成本高以及需要安全验证以排除潜在的细胞毒性或免疫原性效应。

总体而言，这项工作支持合理开发基于细菌素的干预措施，以提高禽类生产中的微生物安全性并减少对抗生素的依赖，对兽医医学、禽类生产和食品微生物学的应用具有更广泛的意义。通过结合现代基因组学工具和合成生物学方法，研究人员展示了一条从自然发现到工程优化的完整路径，为应对抗生素耐药性挑战提供了创新解决方案。