基于微流控芯片与磁珠核酸提取技术的非洲猪瘟现场快速诊断系统研发与应用

《Talanta Open》：Design and Fabrication of Microfluidic Chip and Integrated Nucleic Acid Rapid Diagnosis Device

本文针对非洲猪瘟(ASF)现场快速检测需求，研发了一种集成核酸快速检测装置(INARDD)。该设备结合微流控芯片与环介导等温扩增(LAMP)技术，实现了从样品输入到结果输出的全流程自动化，检测限达102 copies/μL，临床验证显示灵敏度94.1%、特异性97.7%。该便携式设备成本仅69.1美元，为ASF现场筛查提供了经济高效的解决方案。

　　

非洲猪瘟（African Swine Fever, ASF）作为一种致死率接近100%的烈性传染病，给全球养猪业带来了巨大经济损失。由于缺乏有效疫苗，研发快速准确的诊断方法成为疫情防控的关键。传统PCR检测方法需要精密的热循环设备和复杂的预处理步骤，难以在现场环境中应用。虽然等温扩增技术为现场诊断提供了新思路，但现有方法大多需要外部设备辅助或人工操作步骤，无法实现真正的"样品进-结果出"一体化检测。

在这项发表于《Talanta Open》的研究中，重庆大学光电工程学院的任文举团队成功开发了一种低成本的微流控芯片和集成核酸快速检测装置（INARDD）。该系统基于比色原理结合磁珠核酸提取技术，采用微数控机床（CNC）和3D打印制造，实现了核酸提取、转移、环介导等温扩增（Loop-mediated Isothermal Amplification, LAMP）和检测的全流程自动化，无需外部设备或人工干预。

研究团队采用的关键技术方法包括：基于聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）材料的微流控芯片设计与加工技术，通过微数控机床制备反应腔室和通道；磁珠转移控制技术，利用伺服电机驱动永磁体实现磁珠在不同腔室间的转移；LAMP等温扩增技术，结合钙黄绿素（calcein）比色法进行结果判读；TCS34725颜色传感器检测技术，实现结果自动判读。临床样本来源于重庆市畜牧科学学院兽医研究所提供的34份ASFV阳性样本和43份阴性样本。

3.1. 疏水处理效果

研究发现，对PMMA材料进行疏水处理可有效阻止试剂在不同腔室间混合，确保核酸提取、纯化和LAMP反应过程的完整性。未处理的芯片会出现试剂渗漏现象，而经过疏水处理的芯片能实现各试剂的有效隔离。

3.2. 通道高度和宽度对磁珠转移的影响

实验表明，通道高度为0.25 mm、宽度为3 mm时，磁珠可在永磁体控制下顺利在不同腔室间转移。较小的通道尺寸会导致磁珠滞留，而3 mm宽度的通道在保证转移效率的同时兼顾了腔室隔离。

3.3. 永磁体与微流控芯片距离的影响

当永磁体与芯片距离为0.5 mm时，磁珠转移效果最佳。距离过大（如3.5 mm）会导致磁力不足，无法完成转移过程。

3.4. 微流控芯片和INARDD的验证

与常规核酸提取方法相比，该系统的核酸提取浓度达到149.13±1.79 ng/μL，A260/A280比值为1.82±0.01，提取效果与传统方法相当。凝胶电泳结果显示，在10²-10⁴ copies/μL浓度范围内均能有效扩增目标序列。

3.5. INARDD检测限确定

通过检测系列稀释样本，确定该系统的检测限为10² copies/μL，在此浓度下的检测率为100%。采用绿色信号强度变化值（ΔG*）作为评价指标，当阈值为45.6时检测性能最佳。

3.6. 临床诊断性能评估

在77例临床样本的盲法测试中，该系统灵敏度达94.1%（32/34），特异性97.7%（42/43），准确率96.1%（74/77）。对猪瘟病毒（CSFV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）等常见病原体无交叉反应。

3.7. 不同温度环境适应性评估

在4°C、25°C和40°C环境下，该系统均能正常启动并获得准确结果，显示出良好的环境适应性。

该研究开发的微流控芯片和INARDD系统成功实现了非洲猪瘟病毒的现场快速检测，整个检测过程仅需60分钟。系统具有成本低（约69.1美元）、便携（2 kg）、自动化程度高等优点，有效解决了传统检测方法在现场应用中面临的设备依赖性强、操作复杂等问题。特别值得一提的是，该系统采用比色法替代荧光检测，避免了复杂的光学设计，大大降低了设备成本和体积。

研究人员通过优化微流控芯片的通道设计、疏水处理和磁珠转移参数，确保了核酸提取和纯化的效率。采用钙黄绿素作为显色剂，结合颜色传感器实现结果的客观判读，避免了人为主观因素的影响。临床验证结果表明，该系统在复杂现场环境下仍能保持较高的检测性能。

这项研究不仅为非洲猪瘟的现场快速诊断提供了实用技术方案，其技术路线也可为其他传染病便携式诊断系统的开发提供参考。随着进一步优化，该系统有望在疫情防控、食品安全保障等领域发挥重要作用，特别是在资源有限和环境条件较差的地区具有广阔应用前景。未来的研究方向包括进一步优化显色剂浓度以实现半定量或定量检测，扩大临床样本量进行更严格的性能验证，以及拓展该方法在其他病原体检测中的应用。