HPV16 E6基因部分缺失在口咽癌与宫颈癌中的检测及其临床意义

《Virus Research》：Detection of partial deletions of the human papillomavirus 16 E6 gene in a subset of oropharyngeal and cervical cancers

本研究针对HPV16相关口咽癌(OPC)和宫颈癌(CC)中E6基因变异与预后的关联问题，通过对日本患者队列的深入分析，首次发现HPV16 E6基因存在部分缺失现象(23% OPC, 13% CC)。研究证实E6缺失导致E6蛋白功能丧失，且与低病毒载量显著相关。在OPC患者中，E6缺失型患者总生存期显著差于完整E6型，多因素分析显示低病毒载量是独立预后因素。该发现为HPV相关恶性肿瘤的预后评估提供了新的生物标志物。

　　

人乳头瘤病毒16型(HPV16)作为最重要的高危型HPV，不仅是宫颈癌(CC)的主要致病因素，近年来在口咽癌(OPC)中的致病作用也日益突出。有趣的是，尽管是同一种病毒引发的癌症，HPV16在宫颈癌和口咽癌中的致癌潜力似乎存在差异，这种差异背后的机制尚未完全阐明。HPV16的致癌性主要归因于其早期基因E6和E7编码的癌蛋白，其中E6蛋白通过结合宿主细胞的E6AP泛素连接酶，形成E6/E6AP复合物，进而降解抑癌蛋白p53，导致细胞增殖失控和肿瘤形成。已有研究表明，HPV16 E6基因的多态性具有种群依赖性，且与病毒的持久性感染和疾病进展密切相关。然而，目前关于HPV16遗传变异，特别是在口咽癌中的变异情况及其对疾病发展和结局影响的研究仍相当有限，来自亚洲人群的数据更是匮乏。为了解决这一知识空白，日本 Kochi 大学的研究团队开展了一项深入研究，系统分析了日本口咽癌和宫颈癌患者中HPV16 E6基因的变异情况，相关成果发表在《Virus Research》上。

研究人员主要运用了实时定量PCR (qPCR) 技术检测和量化肿瘤组织中的HPV16 DNA载量；采用Sanger测序和下一代测序(NGS)技术对HPV16 E6基因进行序列变异分析，以识别缺失突变；利用数字PCR (dPCR) 精确定量混合感染样本中完整型和缺失型E6序列的比例；通过逆转录PCR (RT-PCR) 检测E6 mRNA的表达情况；并借助免疫组织化学(IHC)技术在蛋白水平评估E6的表达。研究队列包括来自Kochi大学医院的379名日本患者（127名OPC患者和252名CC患者）的肿瘤样本。

3.1. Identification of defective HPV16 E6

通过对171份HPV16 DNA阳性肿瘤样本（71例OPC，100例CC）进行E6基因序列分析，研究人员惊人地发现，部分样本存在E6基因的部分缺失。在口咽癌中，缺失率为23%（16/71），在宫颈癌中为13%（13/100）。最常见的缺失片段位于核苷酸7288-7520位点（233 bp缺失）。序列分析排除了样本间交叉污染的可能性。进一步的蛋白结构模型预测显示，这种缺失导致E6蛋白失去两个关键的锌指结构域，从而无法与E6AP和p53正常结合，意味着其致癌功能可能丧失。

3.2. Detection of HPV16 E6 deletion by deep sequencing

为验证Sanger测序的结果并更精确地定位缺失区域，研究人员进行了深度测序。结果显示，在Sanger测序判定为E6缺失的样本中，对应于核苷酸7288-7520区域的测序读长深度极低或完全缺失，而E6完整的样本则在该区域有均匀的读长覆盖，这从技术上确认了E6部分缺失的真实性。

3.3. Expression analyses of HPV16 E6 mRNA and protein in tumors with defective E6

功能验证表明，绝大多数携带E6缺失的OPC（15/15）和CC（12/13）肿瘤样本中，无法检测到E6的mRNA转录本。相反，在随机选择的E6完整型肿瘤中，均能检测到E6的转录本。在蛋白水平，免疫组化染色显示，E6完整型肿瘤组织中E6蛋白呈强阳性，而E6缺失型肿瘤中染色为阴性或极弱，进一步证实E6缺失导致其表达沉默。

3.4. Viral load status in mixed-type tumors with both defective and intact HPV16 E6

部分肿瘤（4例OPC，7例CC）同时存在完整型和缺失型E6序列（混合型）。数字PCR分析显示，在混合型肿瘤中，两种病毒株的载量近乎相等。而在以缺失型为主的肿瘤中，缺失型病毒株占主导地位，完整型病毒株仅以极低拷贝数存在。

3.5. Association of HPV16 E6 deletion with clinical/demographic characteristics and viral load

临床关联分析发现，在OPC患者中，E6缺失状态与较低的HPV16病毒载量显著相关（P < 0.001）。E6缺失组中81%的患者病毒载量低于中位数，而E6完整组仅为39%（P = 0.004）。病毒整合状态在两组间无显著差异。在CC患者中，未观察到E6缺失与病毒载量的显著关联。

3.6. Impact of HPV16 E6 deletion on clinical outcomes

生存分析揭示了E6缺失的重要临床意义。在口咽癌患者中，携带E6缺失的患者其总生存期(OS)和无进展生存期(PFS)均显著差于E6完整型患者（OS: P = 0.011; PFS: P = 0.038）。E6缺失组患者的生存曲线与HPV阴性OPC患者相似。单因素Cox回归分析显示，E6缺失是OPC患者不良预后的风险因素（HR = 2.82）。然而，在多因素分析中，当调整了年龄、吸烟状况，特别是病毒载量后，E6缺失的独立预后意义消失，而低病毒载量则成为OPC患者总生存期的独立负性预测因子。这表明，E6缺失主要通过导致低病毒载量进而影响OPC患者的预后。相比之下，在宫颈癌患者中，虽然E6缺失组也显示出较差的生存趋势，但差异未达到统计学显著性。多因素分析确认晚期临床分期是CC患者最强的独立预后因素。

本研究首次在日本人群的口咽癌和宫颈癌中系统性地鉴定出HPV16 E6基因的部分缺失，并深入探讨了其生物学特性和临床意义。最重要的发现是，在口咽癌中，E6基因的缺失与低病毒载量密切相关，并且是预后不良的标志。虽然多因素分析表明低病毒载量是独立的预后因素，但E6缺失作为导致低病毒载量的潜在原因，其本身具有重要的生物学指示意义。这一发现揭示了HPV16在口咽癌中致癌过程的一个新层面，即病毒基因组的某些变异（如E6缺失）可能导致病毒功能受损（表现为低载量和E6蛋白失活），但这并不意味着肿瘤恶性程度的降低，反而可能与不同的肿瘤生物学行为相关，其生存结局更接近于HPV阴性口咽癌。该研究不仅为理解HPV相关口咽癌的异质性提供了新视角，而且提示在未来HPV检测和分型中，需要考虑E6基因可能存在的缺失情况，以避免假阴性结果。同时，E6缺失状态和病毒载量作为潜在的生物标志物，或可用于口咽癌患者的风险分层和个性化治疗策略的制定。未来需要更大规模的前瞻性研究来验证这些发现的普遍性，并深入探索E6缺失影响肿瘤生物学行为的具体分子机制。