高分辨率空间转录组揭示MCC表皮-真皮微环境差异：空间背景重塑基因表达图谱

《Oncogene》：High-resolution spatial transcriptomics uncover epidermal-dermal divergences in Merkel cell carcinoma: spatial context reshapes the gene expression landscape

本研究针对Merkel细胞癌（MCC）中罕见但具有重要生物学意义的表皮趋向现象，通过高分辨率空间转录组技术首次系统比较了表皮内MCC细胞与真皮内肿瘤核心细胞的转录组差异。研究发现表皮微环境可诱导MCC细胞呈现角质形成细胞分化特征，包括S100A蛋白、CALML3/5等标志物的上调，并证实该过程受p63-PERP轴调控。这一发现揭示了MCC细胞表型可塑性的微环境调控机制，为理解肿瘤-微环境互作提供了新视角。

　　

在皮肤癌研究领域，Merkel细胞癌（MCC）一直以其独特的神经内分泌特征和高度侵袭性挑战着临床治疗。这种罕见但致命的皮肤恶性肿瘤虽然被认为起源于上皮细胞，却鲜少在表皮层中被观察到完整的发生发展过程。更令人困惑的是，少数MCC病例中出现的"表皮趋向"现象——即肿瘤细胞侵入表皮层形成癌巢——为研究者提供了一个独特的自然实验场景：当相同的肿瘤细胞置身于不同的微环境中，它们的生物学特性会发生怎样的改变？

传统观点认为，癌细胞的恶性行为主要受其内在遗传变异驱动。然而越来越多的证据表明，肿瘤微环境（TME）通过复杂的细胞间相互作用，能够显著影响肿瘤细胞的表型特征。在MCC研究中，一个长期存在的谜团是：那些侵入表皮的MCC细胞，在组织学形态上与真皮中的同类细胞相似，但其分子特征是否也保持一致？这个问题由于技术限制一直未能解答，因为从组织切片中精确分离稀少的表皮MCC细胞并进行转录组分析极具挑战性。

为了解决这一难题，研究人员创新性地结合高分辨率空间转录组技术和先进的图像分割算法，对4例具有表皮趋向特征的MCC原发肿瘤进行了深入分析。通过Visium Spatial HD测序平台和bin2cell细胞分割方法，团队成功在单细胞水平上重建了基因表达谱，使得精确比较表皮MCC细胞（epiMCC）、肿瘤核心MCC细胞（cMCC）以及血管周MCC细胞（vasMCC）的转录组差异成为可能。

研究采用的技术方法主要包括：从4例具有表皮和真皮双区结构的原发MCC肿瘤样本获取组织；通过Visium Spatial HD进行空间转录组测序；应用bin2cell算法实现细胞分割和单细胞水平基因表达重建；结合H&E染色和CK20免疫组化进行细胞类型注释；使用单细胞RNA测序数据（GSE226438）进行验证；通过qPCR检测MCC细胞系中PERP、TP53和ANP63表达；在WaGa细胞系中进行TAp63过表达实验。

高分辨率空间测序和细胞分割

研究纳入了4例经CK20免疫组化证实存在表皮MCC细胞的肿瘤样本。通过Visium Spatial HD测序获得了高质量的空间转录组数据，平均每个8μm区域覆盖度达940.1-970.8条读数。利用bin2cell算法成功分割出351,149-363,701个细胞，虽然单个细胞的基因检出数量（149.0-421.9个基因）低于传统单细胞测序，但空间定位准确性得到验证。研究人员通过形态学标志精确选择了表皮MCC细胞（epiMCC）、肿瘤核心MCC细胞（cMCC）、血管周MCC细胞（vasMCC）以及基底和基上层角质形成细胞进行后续分析。

表皮MCC与皮肤鳞状细胞癌共享转录组特征

主成分分析显示，表皮MCC细胞的转录组特征位于肿瘤核心MCC细胞和角质形成细胞之间，且更接近基底角质形成细胞。差异表达分析发现，表皮MCC细胞上调的基因包括编码stratifin的SFN基因、钙结合S100蛋白基因（S100A8、S100A9）以及钙调蛋白样基因（CALML3、CALML5）。这些基因特征与皮肤鳞状细胞癌（cSCC）的标志物高度相似，基因集富集分析证实了cSCC标志物（如S100A2、FABP5、KRT6A/B和SPRR1B）的显著富集。对无表皮侵犯的MCC样本的对照分析进一步证实，这些表皮相关基因的表达仅限于正常表皮区域，而在真皮肿瘤区域几乎缺失。

空间转录组结果与单细胞转录组学的交叉验证

通过重新分析独立的单细胞RNA测序数据（GSE226438），研究团队验证了空间转录组的发现。在30,153个原发肿瘤细胞中，鉴定出88个表皮MCC细胞、8,551个肿瘤核心MCC细胞和598个血管周MCC细胞。PCA分析显示表皮MCC细胞和血管周MCC细胞分布在表型谱系的两端。差异表达分析揭示了表皮MCC细胞中上皮相关基因（如SPRR1A、CLDN4）以及应激反应基因（如JUND、GSN、BAG1和GSTP1）的上调。基因集富集分析表明表皮MCC细胞表现出上皮发育和角质形成细胞分化增强，而肿瘤核心MCC细胞则显示免疫激活和增殖特征。

表皮分化调节子在表皮MCC细胞中活跃

转录因子活性推断分析显示，表皮MCC细胞中E2F1、TFDP1和TP63（编码p63）的调节子活性增强。功能分析发现114个在表皮MCC细胞中上调且受这些转录因子共同调控的基因，这些基因主要富集于细胞周期调控、DNA复制、染色质重塑、p53信号和细胞衰老等通路。值得注意的是，MCM3、CCNA2、CCNB1和CDK4等细胞周期关键基因的表达上调，表明表皮MCC细胞具有独特的细胞周期调控特征。

p63活性上调导致PERP增强

研究发现PERP（p53凋亡效应器相关蛋白）在表皮MCC细胞中显著上调，该基因是p53家族成员（包括p63）的直接靶标，参与上皮细胞黏附结构——桥粒的形成。空间表达可视化显示CCER2和PERP的共表达在表皮区室中更为常见。肿瘤转录元程序活性分析进一步证实表皮MCC细胞中上皮衰老和细胞周期调控程序增强。

实验性TAp63过表达诱导PERP

鉴于p63在表皮MCC细胞中的活性增强，研究人员假设PERP上调是p63介导的转录组转变的结果。qPCR检测发现MCC细胞系中仅表达ΔNp63异构体，而TAp63未检测到表达。通过在WaGa细胞系中过表达TAp63，证实了PERP和TP53的表达上调，同时ΔNp63表达下降，验证了TAp63-PERP轴的调控关系。

研究结论与意义

这项发表于《Oncogene》的研究首次揭示了MCC细胞在表皮微环境中发生的深刻转录组重编程。研究表明，表皮MCC细胞通过激活p63-PERP轴，获得了类似角质形成细胞的分化特征，包括S100A蛋白、CALML3/5等标志物的表达上调。这种微环境驱动的表型可塑性不仅解释了MCC与皮肤鳞状细胞癌之间的临床关联，也为理解肿瘤细胞如何适应不同组织环境提供了新视角。

特别值得注意的是，表皮MCC细胞中CALML3和CALML5的表达模式与真皮中的CALM2形成鲜明对比，反映了不同微环境对钙信号通路的重编程。而p63活性的增强及其对PERP的调控，则提示表皮微环境可能通过激活分化程序来限制肿瘤细胞的侵袭性。

这些发现具有重要的临床意义：首先，表皮趋向现象可能代表MCC的一种分化状态，而非单纯的侵袭行为；其次，p63-PERP轴可能成为预测MCC预后的生物标志物；最后，针对微环境诱导的分化程序进行治疗干预，可能为控制MCC的塑性和治疗抵抗提供新策略。该研究强调了在肿瘤生物学研究中考虑空间背景的重要性，为未来开发微环境导向的癌症治疗奠定了理论基础。